10外源表达产物的分离纯化.ppt

A 重组蛋白分离纯化方法选择的基因原则 B 离子交换层析 离子交换现象 十八世纪中期由Thompson所发现，后来J.Thomas Way全面研究。 1935年B.A.Adams和Holmes研究合成了具有离子交换功能的高分子材料，第一批离子交换树脂。随后几年里又发展了多种类型离子交换树脂并在水处理方面得到应用。 离子交换树脂的大发展主要是在二次世界大战以后。 (a)阳离子交换树脂 （b）阴离子交换树脂 C 凝胶层析 D 亲和层析 E 膜分离 概述 近20年发展起来的膜分离技术，已广泛用于生物工程、食品、医药、化工等工业生产及水处理等各个领域；膜分离技术是用半透膜作为选择障碍层，允许某些组分透过而保留混合物中其它组分，从而达到分离目的的技术。 膜分离技术它具有设备简单、操作方便、无相变、无化学变化、处理效率高和节省能量等优点，已作为一种单元操作日益受到人们极大重视。 概述 1925年以来，差不多每十年就有一项新的膜过程在工业上得到应用 30年代 微孔过滤 40年代 渗析 50年代 电渗析 60年代 反渗透 70年代 超滤 80年代 气体分离 90年代 渗透汽化 现代 EDI技术 概述 1960年Loeb和Sourirajan制备出第一张具有高透水性和高脱盐率的不对称反渗透膜，是膜分离技术发展的一个里程碑。自此以后，不仅在膜材料范围上有了极大扩展，而且在制膜技术、组件结构及设备研制方面也取得了重大进展。 F 原核生物表达的重组蛋白质量检测 D 亲和层析 分离膜的基本性能 天然高分子膜 醋酸纤维素、硝酸纤维素、再生纤维素 合成聚合物膜 聚砜、聚酰胺、聚烯、含氟聚合物 膜的分类 按膜的材料分类： 无机材料膜 陶瓷、微孔玻璃、不锈钢、碳素 将膜固定在合适的支撑物上即构成膜组件，商品化的膜组件有： 管式、板式、螺旋圈式、中空纤维（毛细管） 凝胶介质的基本性质 葡聚糖凝胶的种类有G10、G15、G25、G50、G75、G100、G 150、G200，G50即表示每克干凝胶的吸水量为5.0毫升 葡聚糖凝胶对碱比较稳定，在酸性环境中其糖苷键易水解 湿态的葡聚糖可加热到110℃，干的则能耐受120℃高温 葡聚糖凝胶（ Sephadex ） Sephadex LH是羟丙基化的Sephadex，这类层析介质的流动相既 可使用缓冲水溶液，也可使用极性有机溶剂，因此适用于非水溶性溶 质的凝胶过滤 凝胶介质的基本性质 琼脂糖凝胶是由琼脂中分离出来的天然凝胶，常见的有Sepharose （ Sepharose 2B、4B、6B，数字代表干胶的百分比 ）和Bio-Gel-A等 （Bio-Gel-A 0.5M、1.5M、5M、15M、50M、150M，数字X106代表排 阻限度。 琼脂糖凝胶 当温度高于50℃时琼脂糖凝胶便融化，只能在较低的温度下使用。 琼脂糖凝胶是一种大孔凝胶，因而适合于分离分子量较大的生物大 分子物质（如蛋白质和DNA）。 Sepharose CL是二溴丙醇交联的琼脂糖，其孔径大小和分离范围 与普通琼脂糖一样，但热和化学稳定性增加，能高温消毒。 凝胶介质的基本性质 聚丙烯酰胺凝胶是一种以丙烯酰胺为单位由甲叉双丙烯酰胺交联 而成的人工合成凝胶，控制交联剂的用量可制成各种型号的凝胶，交 联剂越多，孔隙越小。 聚丙烯酰胺凝胶的商品名为Bio-Gel，型号从P-2至P-300共10种 聚丙烯酰胺凝胶 （ 数字X1000就相当于该凝胶的排阻限度） 凝胶介质的选用原则 将样品中的大分子物质与小分子物质分开，称为组别分离，其分 离策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 组别分离一般选用Sephadex G-25或G-50，对于小肽和低分子量 的物质（分子量范围1000-5000）的脱盐可选用Sephadex G-10、G- 组别分离 15、Bio-Gel P-2或P-4 凝胶介质的选用原则 将样品中一些分子量比较接近的物质分开，这种分离叫分级分离 该策略是使高分子物质完全被排阻，小分子物质完全渗入凝胶内。 分级分离一般选用排阻限度略大于样品中最高分子量物质的凝胶 在层析过程中，样品中各组份均能不同程度地深入到凝胶内部，但由 分级分离 于深入凝胶空隙程度上的差异，最后得到分离。 凝胶层析的基本操作 平衡溶液的流速应低于层析时需要的流速 注意凝胶的断层和气泡 层析柱平衡 操作压控制 平衡和洗脱时应维持流速恒定 恒定的操作压是恒流的先决条件 凝胶层析的基本操作 上