TALEN靶向基因操作技术.docVIP

TALEN靶向基因操作技术 技术介绍：?? TALE 技术（Transcription activator–like effectors）是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前TALE技术主要有两种应用：?? 1）TALEN（transcription??activator-like (TAL) effector nucleases）技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。?? 2）TALEA（transcription activator-like (TAL) effector activator）技术，针对基因启动子上游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆cDNA。???????????????????????????????? ?? TALE技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。 技术特点：?? 1.无基因序列、细胞、物种限制。?? 2.TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计简单准确、实验周期短、成本低。?? 3.成功率几乎可达100%。 ?? 4.毒性低、脱靶情况少。?? 5.克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。 TALE构建与应用：?? 1.TALE靶点识别模块构建 ?? TAL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。为获得识别某一特定核酸序列的TALE，只须按照DNA序列将相应TAL单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。 ?? ?? 2.TALEN的基因敲除?? 将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界处选择两处相邻（间隔13-22碱基）的靶序列（一般16-20个碱基）分别进行TAL识别模块构建。将这两个相邻靶点识别模块（分别）融合克隆到FokI的N-末端，形成真核表达载体，得到TALEN质粒对。???????????????????????????????? ?? 将TALEN质粒对共转入细胞中可实现靶基因敲除。TALEN质粒对共转入细胞后，表达的融合蛋白，分别与靶位点特异结合，由于两个TALEN融合蛋白中的FokI临近，形成二聚体，发挥非特异性内切酶活性，在两个靶位点之间剪切DNA，形成DSB（Double-Strand????Breaks）,诱发DNA损伤修复机制。细胞可以通过NHEJ（Non-homologous????End????Joining）修复DNA，在此修过程中或多或少地删除或插入了一定数目的碱基，造成移码，形成目标基因敲除突变体。 ?? 3.TALEN的同源重组???????????????????????????????? ?? 当通过TALEN产生DSB后，若能提供同源修复模板，细胞可通过同源重组方式修复DNA，因此可以对内源DNA做更精细的操作，如点突变（磷酸化位点）、保守区域替换、N端或C端加标记（GFP、HA、Flag…）等等。通过TALEN产生DSB后，在外源模板存在的情况下，发生同源重组修复DNA???????????????????????????????? ?? 4.TALEA的转录激活?? 将识别特异DNA序列的TALE与转录因子激活区域VP64(VP64????Activation????Domain)融合，可构建成识别启动子上特异DNA序列的转录激活因子TALEA。在实际操作中，需在目标基因的启动子上游选取靶序列（一般12-18个碱基），构建TAL识别模块。将识别模块TALE融合克隆到VP64的N-末端，形成真核表达质粒TALEA。将T