实时荧光定量PCR技术研究及其在医学领域的应用.pdfVIP

堡壁理壁曼壁墼 至箜 鲞筮 塑 !： ! ： !』 壁 ! 垦 堕垒口 1579 实时荧光定量 PCR技术研究及 其在医学领域的应用 鲍 鑫 刘向国 刘 茜 安徽中医学院组胚教研室，安徽省合肥市 230038 摘要 实时荧光定量PCR (real-timequantitativePCR，FQ-PCR)是指在 PCR反应体系中加人荧光基团，利用荧光信 号积累实时监测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。本文综述 了FQ-PCR技术的 原理特点及其在医学领域中的应用和研究进展。 关键词 实时荧光定量 PCR 原理 应用 中图分类号：R445 文献标识码：A 文章编号：1001—7585(2013)12—1579—03 聚合 酶链 式反应 (Polymerasechainreaction， 获得样 品的 Ct值就可 以从标准 曲线计算 出该样 品 PCR)自 1989年开始应用 以来 ，不仅在分子生物学 的起始拷 贝数 [8]。 领域成为常规 的方法和手段 ，而且在遗传病 的诊 断 、 2 实 时荧光 定量 PCR技 术 中荧光标 记方 法 的分类 临床标本病原体检测等方面得到 了广泛应用 。由于 在 实时定量 PCR技术 中，要实现 PCR产物 的 传统的 PCR技术只能对基 因的监测作定性 的分析 ， 实时检测 ，进而定量起始模板 的量 ，一般借助于荧光 也就 只针对特定基 因的探测做 出有或无 的诊 断 ，无 物质产生 的荧光强弱来实现 。实时定量 PCR 的检 法精确地定量 出所表现 的基 因数量 ，使得一些量化 测常用 的有荧光染料嵌入法和探针法 。 的问题始终无法解 决 。因此对 PCR产物进 行准确 2．1 荧光 染料 嵌入 法 SYBR Green是 一种 只与 定量 成 为 PCR 技 术 发 展 的重 要 方 向[1]。直 到 DNA双链结合 的荧光染料 ，在反应体系 中加入过量 1996年 美 国 AppliedBiosystems公 司推 出实 时荧 SYBR荧光染料 ，当它与 DNA 双链 结合 时发射 荧 光定量 PCR(teal-timequantitativePCR，FQPCR) 光信号 ，而不掺人链 中的 SYBR染料分子不会发射 技术 。由于该技术不仅实现 了 PCR从定性到定量 任何荧光信号 ，从而保证荧光信号的增加与 PCR产 的飞跃 ，而且与常规 PCR相 比，融合 了PCR 高灵敏 物 的增加完全 同步 。具体工作原理见 图 1。它 的最 性 ，DNA 杂交 的高特异性 和光谱技术 的高精 确 定 大优 点就是可 以与任 意 引物 、模板相配合 ，用于任意 量等优点 ，直接探测 PCR 过程 中荧光信号的变化 ， 反应体系 ，检 i贝0成本低 。不足之处是 由于染料可 以 以获得特定 区段扩增产物定量 的结果 ，不 需要 PCR 与所有 的 DNA 双链分子结合 ，因此 易受到非特异 后处理或 电泳检测 ，完全 闭管操作 (整个过程 中仅有 性扩增和引物二 聚体 的影 响，使定量结果不 可靠 。 加入样 品的一次开盖)，一举克服 了常规 PCR 技术 所 以，其特异性不 如探针法 。针对这一 问题可 以通 的诸 多难题 [4]。 目前 FQ-PCR 已经被广泛应用于基 过热循环仪 内设 定 的程序过程对 扩增 曲线进行分 础科学研究 、临床疾病诊断 、疾病研究及药物开发等 析 ，以区分 由 PCR产物和本底造成 的荧光信号 ；也 领域Lsq]。本文对实 时荧 光定量 PCR 的原理及 其 可 以通过设计 特异性 引物 ，优化 PCR 的反应条件 ， 减少或去 除非特异性物产物和 引物二聚体 的产生 以 应用现状等进行综述 。