L-缬氨酸定量测定方法的研究——纸色谱-色斑洗脱比色法.pdfVIP

维普资讯 第20105鬻年3月 JOURNALOFG广UA西NG工XI学UN院IV学ER报SITYOOFFTECHNOLOGY VoM1．ar16．2N0o05．1 文章编号 1004-6410 (2005)01-0030—03 L一缬氨酸定量测定方法的研究 — — 纸色谱一色斑洗脱比色法 余 炜，伍时华，陈玲芬，黄显程 (广西工学院生物与化学工程系，广西 柳州 545006) 摘 要：通过 “纸色谱一色斑洗脱比色法”定量测定发酵液中L一缬氨酸的实验研究，考察了测定波长、色斑洗脱时间、 温度、洗脱液、稳定性等因素对测定效果的影响，确定了定量测定条件。此方法的测定结果与高速氨基酸分析仪测定 结果相吻合，方法回收率为 93．45 。 关 键 词：纸色谱一色斑洗脱 比色法 ；定量测定 ；L一缬氨酸 中图分类号：TQ922．9 文献标识码 ：A 0 前言 用微生物发酵法生产 L一亮氨酸，副产少量 L一缬氨酸是不可避免的。随培养基组成和发酵过程控制条件 的不同，副产 L一缬氨酸的量不同。从发酵液中分离提取 L一亮氨酸的过程 中，为考察分离效果需随时检测L一 缬氨酸的含量 ，待测样品多、工作量大，特别是受设备条件限制，因而有必要建立切合实际、比较简便的定量 分析方法。本文用纸色谱法[x-33分离发酵液中的L一缬氨酸，经茚三酮显色得到紫色色斑。将色斑洗脱后测定 其吸光度。根据色斑洗脱液颜色深浅与其吸光度成正比的原理，进行了 “纸色谱一色斑洗脱 比色法”定量测定 发酵液 L一缬氨酸的实验研究。 1 材料与方法 1．1 材 料 L一亮氨酸发酵液：由广西工学院发酵工程研究室提供。 1．1．1主要仪器与试剂 754型紫外可见光分光光度计 ；高速台式离心机 ；恒温水浴振荡器。色谱展开剂为：正 丁醇 ：冰醋酸 ：水一4：1：5；显色液为 5g／L茚三酮一丙酮溶液；色斑洗脱剂为：1g／LCuSO 溶液 ：75 乙醇=2：38；标准L一缬氨酸购于美国Sigma公司。 1．2 测定方法 1．2．1 发酵液预处理 用可调微量移液器吸取 0．5ml发酵液于 1．5ml小离心管中，高速离心 (8000r／min)2 min，沉淀碳酸钙和菌体等固形物 ，上清液置于 4℃冷藏待测。根据发酵液中L一缬氨酸浓度确定样品稀释倍 数。 1．2．2 用纸色谱法分离L一亮氨酸 发酵液中的主产物为L一亮氨酸，而副产物L一缬氨酸的性质与L一亮氨酸的性 质非常相似，因此 L一亮氨酸和L一缬氨酸的分离成为准确测定发酵液中L一缬氨酸的含量的关键。本文采用纸 色谱法[2]首先将发酵液中L一缬氨酸分离出来。 1．2．3 色斑洗脱比色 用剪刀把 L一缬氨酸显色斑点滤纸剪成细条状 ，放人比色管中，加入洗脱液 10ml，于 30℃恒温水浴振荡器中，摇动洗脱 30min，用 754型分光光度计于 520nm波长下测定吸光度 。以不同浓度 收稿 日期 ：2005一Ol一14 基金项 目：广西区自然科学基金项 目(桂科青0229012)。 作者简介：余炜 (1971一)，女，陕西省汉中市人 ，广西工学院讲师，理学硕士。 维普资讯 第 1期 余 炜等 ：L一缬氨酸定量测定方法的研究一纸色谱一色斑洗脱 比色法 31 L一缬氨酸标准液显色斑点对应的吸光度为纵坐标，L一缬氨酸含量为横坐标 ，绘制测定L一缬氨酸的标准工作 曲线。由标准工作曲线的线性回归方程导出发酵液中L一缬氨酸含量的计算公式。每次测定时，剪下与样品斑 点面积相当的无显色斑点的滤纸作空白对照。 2 结果与讨论 2．1 洗脱液测定波长的确定 用 754分光光度计对标样和样品的纸色谱色斑洗脱液进行光谱测定，测得最大吸收波长为 520nm。 2．2 纸色谱一色斑洗脱 比色法测定 L一缬氨酸含量 采用纸色谱法将发酵液中的L一缬氨酸分离形成独立的色斑，然后进行洗脱、比色和计算 L一缬氨酸含量 。 2．2．1色斑洗脱 斑点洗脱的关键在于，所用洗脱液能较快地把附着在滤纸上的斑点颜色彻底洗脱下来 ，并 且洗脱液颜色应在一