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第11章 荧光分析法 11.2.2 激发光谱与发射光谱 1. 激发光谱：excitation spectrum 荧光光谱的特征 荧光光谱的特征 荧光光谱的特征 11.3 定量分析方法 11.3.1 荧光强度与荧光物质浓度的关系 1. 光源 2. 单色器： 3. 样品池： 4. 检测器： ? ? ? ? ? cs Fs－F0 Fx－F0 cx 11.3.2 定量分析方法 1、标准曲线法 11.3.2 定量分析方法 2、比例法（对照法） 例 题 在测量分子荧光强度时，要在与入射光成直角的方向上进行测量，这是由于： A 荧光是向各个方向发射的，为了减小透射光的影响 B 只有在与入射光成直角的方向上，才有荧光 C 荧光强度比透射光强度小 D 荧光的波长比入射光波长长 11.4 荧光分析技术及应用 光源 激发单色器 样品池 发 射 单色器 检测器 荧光分光光度计的主要部件 氙灯： 波长范围250~700nm，300~400nm谱线强度几乎相等 光电倍增管 激发单色器、发射单色器 石英、四面透光 * * Molecular fluorometry 11.1 概 述 荧光：物质分子接受光子能量被激发后，从激发态的最低振动能级返回基态时发射出的光。 荧光分析法：根据物质的荧光谱线位置及其强度进行物质鉴定和含量测定的方法。 荧光分析法的优点：灵敏度高、选择性好 第一激发单重态的最低振动能级 分子荧光分析法（molecular fluorometry） 自旋量子数s=1/2或-1/2 总自旋量子数 S＝0 多重性 2S＋1＝1 11.2 基本原理 基态 单重态 激发 单重态 激发 三重态 荧光和磷光产生示意图 吸收 振动 驰豫 内部能量转换 荧光发射 体系间 跨越 磷光发射 振动驰豫 内部能量转换 处于激发态各振动能级的分子通过与溶剂分子的碰撞而将部分振动能量传递给溶剂分子，其电子则返回到同一电子激发态的最低振动能级的过程。 当两个电子激发态之间的能量相差较小以至其振动能级有重叠时，受激分子由高电子能级转移至低电子能级的过程。 无辐射跃迁 关于荧光 荧光的产生需经历两个过程： 吸收 发射 第一激发单重态的最低振动能级 振动驰豫 内部能量转换 例 题 1. 所谓荧光，即某些物质经入射光照射后，吸收了入射光的能量，从而辐射出比入射光： A 波长长的光线 B 波长短的光线 C 能量大的光线 D 频率高的光线 ? 荧光光谱 表示不同激发波长的辐射引起物质发射某一波长荧光的相对效率。 2. 发射光谱：fluorescence/emission spectrum F –λex F-λem 表示在所发射的荧光中各种波长组分的相对强度。 （1）斯托克斯位移（Stokes shift）：λem ＞ λex 产生原因：能量损失 （1）内转换和振动驰豫 （2）激发态分子返回基态不同振动能级 （3）激发态分子与溶剂分子的相互作用 （2）荧光光谱的形状与激发波长无关 产生原因： 荧光发射是从特定的激发态返回基态 荧光光谱的强度与激发波长有关 （3）荧光光谱与激发光谱的镜像关系 产生原因： 电子基态的振动能级分布与激发态的相似 例 题 下列说法哪个是错误的？ A 荧光光谱的形状与激发波长无关 B 荧光波长总是大于激发光波长 C 荧光光谱的最短波长和激发光谱的最长波长相对应 D 最长的荧光波长与最长的激发光波长相对应 ? 11.2.3 分子结构与荧光的关系 分子产生荧光必须具备两个条件： 1. 强的紫外－可见吸收 2. 一定的荧光效率 荧光效率（荧光量子产率） 1. 荧光效率 φf 0～1 2. 分子结构对荧光效率的影响 分子产生荧光必须具备两个条件： 1. 强的紫外－可见吸收 2. 一定的荧光效率 长共轭结构 分子的刚性和共平面性 取代基作用 λex 205nm 286nm 356nm λem 278nm 321nm 404nm φf 0.11 0.29 0.36 （1）长共轭结构 结论：π电子共轭程度越大，荧光强度（荧光效率）越大，荧光波长长移 联苯φf 0.2 芴φf 1.0 （2）分子的刚性和共平面性 结论：在相同的长共轭分子中，分子的刚性和共平面性越强，荧光效率越大，荧光波长长移 2、分子的刚性和共平面性 （3）取代基作用 给电子基团 吸电