三个猪戊型肝炎病毒ORF2基因连续片段核酸疫苗构建.pdfVIP

第八届全国会员代表大会暨第十五次学术研讨会论文集  三个猪戊型肝炎病毒 ORF2 基因连续片段核酸疫苗的构建 李斌 1,2，苏乾莲 1,2，赵武 1,2*，秦毅斌 1,2，梁家幸 1,2，肖爱欢 1,2,3，卢冰霞 1,2,3，李莹莹 1,2,3，何颖 1,2，段群棚 1,2，姜 佳佳 1,2,3 1,2 ，梁保忠 （1. 广西兽医研究所，广西南宁，530001 ；2. 广西畜禽疫苗新技术重点实验室，广西南宁，530001 ；3. 广西大学动 物科学技术学院，广西南宁，530005） 摘 要 为了研制猪戊型肝炎（HE ）基因工程疫苗，在由猪戊型肝炎病毒（HEV ）ORF2 N 端及中间部分三个连续基 因片段 B1 、B2 、B3 所构建的原核表达质粒 pET32a-B1 、pET32a-B2 、pET32a-B3 的基础上，设计引物扩增基因片段 LB1 、LB2 、LB3 ，分别与真核表达载体pEASY-M1 Expression Vector 直接进行 T-A 连接，构建得到重组真核表达质粒 pEASY-a 、pEASY-b 、pEASY-c 。将真核表达质粒pEASY-a 、pEASY-b 、pEASY-c 分别转染 293T 细胞，经实时荧光定 量 RT-PCR 检测目的基因，证实这三个真核表达质粒可转染 293T 细胞表达目的蛋白。经 SDS电泳分析、Western Blot 鉴定，结果表明真核表达质粒 pEASY-a 、pEASY-b 、pEASY-c 在转染 293T 细胞中表达的目的蛋白具有良好的 HEV 抗原性。从而获得了三个 HEV ORF2 连续片段的候选核酸疫苗，为今后进一步深入研究奠定了基础。 关键词 猪戊型肝炎病毒；ORF2 ；真核表达质粒；鉴定；核酸疫苗 戊型肝炎（Hepatitis E ，HE ）是由戊型肝炎病毒（Hepatitis E Virus ，HEV ）引起的病毒性肝炎， 以水源性暴发流行和急性散发为特点，主要通过粪— 口途径传播，是一种新发重要人兽共患传染病， 呈全球分布，严重危害人们身体健康和动物养殖业健康发展，是发展中国家的主要公共卫生问题之一 [1] [2] 。近年来，在发达国家的发病率也呈上升趋势 。基因序列分析表明，从动物体内分离的HEV 与人 的 HEV 有极高的基因同源性，很多研究及病例证明了 HE 是一种可以通过食物或水源环境传播的人 兽共患疫病，其中猪是目前 HEV 的重要储库。这主要是因为人猪间的接触密切，而且猪在所有被调 查的动物中感染率最高[3] 。 HEV 为单股正链无囊膜的 RNA 病毒，可分为四种基因型（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ型）[4] ，不同地区分 离的 HEV 毒株有所不同，但 HEV 只有一种血清型[5] 。其基因组长约 7.3kb，包含 5’非编码区（5’UT R ）大约 25 个核苷酸和 3’非编码区（3’UTR ）65～74 个核苷酸，中间为 3 个开放性阅读框（ORF ）： ORF1、ORF2 和 ORF3[6] 。其中 ORF2 基因长约 2kb ，位于编码区的 3’端，其编码病毒衣壳蛋白 pOR F2 ，为一个含 660 个氨基酸的糖基化蛋白，其中至少含有 7 个线性抗原表位，特别是其 C 末端，有多 个重要免疫抗原表位[7] ，pORF2 蛋白具有良好的抗原性，是目前公认最有应用前景的候选亚单位疫苗。 应用 HEV 疫苗进行免疫预防是最为经济、有效、可行的 HE 防控手段。目前HEV 尚不能在体外细胞 中进行稳定的大量培养，从而阻碍了HEV 灭活疫苗和弱毒疫苗的研制，现在 HEV 疫苗研究重点方向 是基因工程疫苗的研发。目前 HEV 基因工程疫苗的研究发主要集中在 ORF2 ，且对ORF2 的研究主要 集中在 C 端，现已确定了 C 端各种表位和特征，但有关 ORF2 N 端及中间部分的研究报道甚少。因 此，对 ORF2 不同区域进行研究，筛选反应原性好、免疫原性高的抗原片段，对于 HEV 基因工程疫