盐析萃取法提取分离盾叶薯蓣发酵液中甾体成分与虎杖发酵液中白藜芦醇.pdfVIP

盐析萃取法提取分离盾叶薯蓣发酵液中甾体成分和虎 杖发酵液中白藜芦醇 董悦生 刘琳 王辉 修志龙 大连理工大学生命科学与技术学院 辽宁 116024 天然产物及生物转化产物生产中，提取分离成本中占有较大比例。目前常用的提取分离 方法均包括固液分离、溶剂提取、溶剂蒸发等单元操作，步骤繁琐，收率低、周期长等因素 增加了天然产物及其生物转化产物的提取分离成本。近年来新型产物分离技术的研究与探索 严重落后，缺乏适合的分离方法已成为天然产物及其生物转化产物生产的瓶颈，借鉴蛋白质、 酶等生物大分子分离中不断涌现的分离过程集成化与耦合的新型分离技术(1) ，天然产物及 其生物转化产物的分离提取将逐渐趋向于分离过程的耦合与集成化。 当能与水混溶的普通有机溶剂，如乙醇、异丙醇、丙酮等，加入到某些电解质水溶液中， 利用盐离子的水化作用，使盐离子夺取原来与有机溶剂水合的水分子而释放出有机溶剂分 子，因乙醇具有较强的亲水性，所以该现象也称为“双水相”，该项技术曾在天然产物和金 属离子的萃取分离得到了应用(2, 3) 。本课题组将该技术用于发酵产品、天然产物的生物转 化产物提取分离中，通过调节无机盐和亲水性有机溶剂的比例，目标产物集中于亲水性有机 溶剂相，发酵液中强极性物质富集于水相，菌体集中于两个液相的中间，形成双水相体系， 可以将固液分离，溶剂提取，浓缩等多步操作整合为一步进行。在此基础上，针对不同极性 的目标产物，在体系中添加石油醚、正己烷等弱极性有机溶剂，形成三液相体系，进一步实 现了弱极性物质和中强极性物质的分离，进而发展成为将提取分离过程耦合与集成的新方法 -盐析萃取法。该方法在天然产物及其生物转化产物的提取分离中能够发挥巨大作用。 薯蓣皂苷元(俗称薯蓣皂素，Diosgenin)在结构上与甾体激素类药物相似，是生产甾体激 素类药物最理想的前体，世界上生产的甾体激素类药物中 60% 以上采用薯蓣皂苷元为原料 进行生产。目前世界年产量3000 吨，我国是世界上薯蓣皂苷元第一生产大国，年产量约1500 吨(4) 。薯蓣皂苷元在植物内以C-3 位通过苷键与糖链相连，在生产中主要采用酸水解法， 该方法简便易行、成本也较低，但环境污染严重，目前生产1 吨薯蓣皂苷元要产生518 吨废 水，其 COD 高达 50,000mg/ml，且生物降解能力弱，离子沉积和固体污染也很严重，而且 使用的强酸对薯蓣皂苷元母核有破坏作用，薯蓣皂苷元得率较低(5) 。本课题组已开展了盾 叶薯蓣化学成分的研究，建立了转化体系中甾体皂苷和苷元的定量分析方法(6) ，开展了米 曲霉转化盾叶薯蓣生产薯蓣皂苷元的研究(7)，并从本课题保存的数百株微生物进行了筛选， 发现一株哈茨木霉DL3012 具有高效的转化作用，薯蓣皂苷元的得率达到30.05mg/g 药材， 是酸水解法的1.05 倍，甾体皂苷的摩尔转化率达到72%(8) 。 白藜芦醇属于二烯苯类化合物，具有抗癌、抗病毒、抗菌、保护心血管等多种药理作用， 所以近年来被广泛应用食品添加剂、保健品和化妆品。中药虎杖中白藜芦醇类化合物含量较 高为1.2~3.6%(9)，但主要以白藜芦醇苷形式存在，同时虎杖中尚还有生理活性物质大黄素。 本课题组筛选出高产β-葡萄糖苷酶菌株米曲霉，用米曲霉直接对虎杖粗粉末进行发酵，成 功地将其中的白藜芦醇苷转化为白藜芦醇。采用5L 发酵罐发酵24h ，白藜芦醇苷的转化率 达 105%，白藜芦醇的浓度提高到原来的3.4 倍(10) 。 为了完善生物转化法生产薯蓣皂苷元和白藜芦醇的方法, 我们开展了盐析萃取法提取 盾叶薯蓣和虎杖发酵液中薯蓣皂苷元和白藜芦醇的研究。 1. 材料与方法： 盾叶薯蓣和虎杖分别购自陕西宝鸡和大连仙草堂大药房。 哈茨木霉转化盾叶薯蓣(8)和米曲霉转化虎杖(10)发酵液制备方法和含量分析方法(6)参 见以发表论文。还原糖含量采用硫酸-苯酚法，蛋白含量采用考马斯亮蓝法。 微波辅助双水相、三液相方法，将哈茨木霉转化盾叶薯蓣和米曲霉转化虎杖的发酵液中 加入不同质量的硫酸铵，搅拌使硫酸铵溶解后加入不同质量的乙醇，石油醚，超声处理2min ， 静置3 小时后，分析石油醚相、乙醇相和水相中目标产物、还原糖和蛋白含量。 2. 实验结果 2.1 盐析萃取技术提取分离盾叶薯蓣发酵液中的薯蓣皂苷元 微波辅助双水相盐