多重免疫荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜技术在病理研究中应用.pdfVIP

2009年全国病理学技术进展和应用研讨会 玻片和盖玻片处理小”1。 七、在HE切片中，时常可发现细小的黑点，类似色素样颗粒(也称空气色素颗粒) 此种颗粒一般敞在或成片状，圆形或小规则形，易被误认为黑色素或福尔马林色素沉着。我们发现 肝脏组织中更易出现。主要原因：(1)干封片引起。切片染色甭，封同时切片中的■甲苯已完全挥发。 (2)也可能是树胶中含有水份。(3)树胶封同剂过稀，?‘1封同剂干燥或待■甲苯挥发后切片内可出现小 黑点。(4)树胶浓度过商，流动小均匀，滴加的封嗣剂4i能完全覆盖切片所致。(5)切片脱水、透明不 彻底。解决办法：①染色后的切片，在无水酒精脱水后经过石碳酸一■甲苯混合液(1：3，冈石碳酸易 溶于醇、水发苯，透明力较强)处理或纯■甲苯充分透明后，再用树胶封同，可防J卜该色素颗粒产生： ②调整树胶的浓度，不能过浓或过稀。建议：湿封片。 八、HE切片，镜下出现似细小水珠一样的杂质，主要分布在腺体的周围，时隐时现 是台为水珠，要看切片在显微镜高倍下是否清楚，若组织细胞结构清晰，可能是在封同时，切片干 洞而造成的细小气泡所致。处理方法：①脱水不净廊洒精重新脱水。②切片干涸虑重新在-二甲苯中脱胶 后再封同。 九、切片内产生气泡的原因 切片厚薄不均，为搓板样，切片不平整，胶液扩散升i均：展片水温过低，组织未展开，或水底产生 的气泡浮在组织上；脑组织等在捞片时组织下面亦易产生气泡；封同胶过稀或过稠；封同时操作不当所 致。盖玻片先一侧置于滴有胶液的组织上，然后缓慢放下。 综上所述，HE染色组织出现模糊不清(灰染)等现象，原因是多方面的，其中有的并非染色 技术问题，而是由于染色前的取材、同定、脱水、透明、浸蜡、包埋、切片等处理不当所致。 而在诸多冈素中，尤以固定为重要，它是组织切片梨色成败的首要冈素。 多重免疫荧光标记及激光扫描共聚焦显微镜技术在病理研究中的应用 30001) 刘育艳 庞雪芬(山西医科大学细胞生理学教育部重点实验室0 随着分子生物学突飞猛进的发展，激光扫描共聚焦显微镜技术的推广辅以各种免疫荧光探针或荧光 染料与被检测物质特异性结合，不仅可观察组织细胞切片而且还能对活细胞的形态结构、1分子和离子变 化进行实时动态的观察和检测，多重免疫荧光标记结合激光共聚焦显微镜技术的应用越来越广泛，是日 前细胞分了水平虑用最多的一种新挝研究方法。 免疫荧光标记技术是将抗体(或抗原)标记上荧光素，使其与组织细胞内的相应抗原(或抗体)结 合后，通过激光共聚焦显微镜观察检测特异的荧光信号，定位定性定最检测标本中的待测抗原(或抗体)。 多重免疫荧光标记法比传统的单荧光标记法结果可靠，获得的信息多，具备灵敏性高、对比度好、图像 清晰等优点；比酶免疫组化法操作简单，试剂用帚少成奉低。多重荧光标记可同时在一个标奉上进行多 个目的蛋白的研究，为探畲它们之间的相互关系提供了便利条件。在组织切片及细胞涂片上进行免疫荧 光标记和检测麻注意： 一、标本制片 2009年全国病理学技术进展和应用研讨会 1、冷冻切片：丁‘术送检的新鲜组织一15℃切20um厚的冷冻切片，附贴在挂有多聚赖氨酸胶的载玻 片上，一20℃冰箱内保存备用；2、石蜡切片：取好材的组织10％中性甲醛液4℃同定6--8h，梯 度酒精脱水，56～58℃石蜡包埋，切5 um厚石蜡切片，置60℃恒温箱烤片40min；3、细胞涂片： 采用“机械一酶消化法”和“细胞器涂片法”将新鲜组织制成细胞涂片，丙酮4C同定lOmin后，一20 一℃冰箱内保存备用。 二、免疫荧光标记 、联合应用FITC、CY3及DAPI等荧光探针，对组织切片或细胞涂片进行荧光标记。 消化lO～20mim 次；15、缓冲}{。油封片。以上从加■抗后的步骤需避光操作。 三、激光扫描共聚焦显微镜技术 激光扫描共聚焦显微镜具备多种功能，可对多重荧光标记的组织细胞分通道逐层扫描，获取一维、 二维及三维图像，拆分多重荧光及组合重叠合成图像，多用于组织细胞内的分了原位定性定量鉴定、细 共聚焦显微镜40倍物镜，分三个通道分别扫描采集图像。第一通道选FITC：激发光488nm，发射波长 530nm，绿色；第二通道选CY3激发光543 发射波长420hm，蓝色。每张切片取四五个视野，分单通道单色荧光图像及多通道多重荧光合成