福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的克隆和其原核表达.pdfVIP

福氏志贺菌2a多药耐药基因marA的克隆及其原核表达 王松泰L2，张继瑜L，魏小娟1，曹小安3，邱昌庆3 (1．中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所新兽药工程重点开放实验室兰州730050；2．甘肃农业大学动物医学院兰州 730070；3．中国农业科学院兰州兽医研究所家畜疫病病原生物学国家重点实验室兰州730046) 【摘要】对福氏志贺菌2a多药耐药相关基因marA进行克隆和原核表达。参考福氏志贺菌2amarA基因序列。设计一对特异 转化宿主菌B1221(DE3)pLys，IlrIG诱导表达目的蛋白。经SDS—PAGE及Western Blotting检测和鉴定，结果表明重组载体 深入研究奠定了基础。 【关键词】福氏志贺菌；marA基因；克隆；原核表达 sp)是一类具有高度传染性和 对福氏志贺菌多药耐药机理的深人研究奠定了基础。 志贺菌属(Shigella 严重危害性的人兽共患肠道致病菌，临床感染可以导 1材料与方法 tlexneri)是最重 致痢疾…，其中福氏志贺菌(Shigella 要的病原。对志贺菌病的防治在世界各国一直受到高 1．1菌种 度重视，但是，由于该病的独特致病方式和它的急性 福氏志贺菌标准菌株21573，购自中国药品生物 发病过程，给临床治疗带来了很大困难。尤其由于抗 制品检定所。 菌药物的广泛应用，志贺菌的耐药性问题正在变得日 1．2载体和菌株 趋严重和突出，志贺菌对大多数抗生素与化学合成抗 pMDl8一T 菌药具有很强的耐药性。 国内外学者对细菌耐药机制进行了广泛的研究， 品，pET一30a表达载体由本实验室保存并提供。 其中多药耐药性的外输泵机制在很多细菌中普遍存 1．3主要试剂 在。外输泵能主动将进入细菌细胞内的药物或其他物 T4DNA连接酶、DNA胶回收试剂盒、质粒提取 DNA 质泵出菌体外，可使细菌对多种化学结构完全不同的 试剂盒、BaraHI和SalI限制性内切酶、250 bp 抗菌药物产生耐药。已有研究表明，在大肠杆菌中 Marker、Ex MarA是一个正调控蛋白，可增强acrAB和tolC的表达，品；福氏志贺菌诊断血清购自宁波天润生物有限公司； 使外排系统活性增强肛1。志贺菌与大肠杆菌同属肠杆 辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG购于Sigema公司。 菌，而有关对志贺菌外输泵的研究此前尚属空白，但 1．4方法 是作为多药耐药性表型的调节子marRAB在我们研究1．4．1福氏志贺茵基因组DNA的提取将福氏志贺 的志贺菌福氏2a基因组结构中是存在的口1，而且与大肠 菌的单个菌落接种于5mL营养肉汤培养基中，37。C恒 000 杆菌marRAB的结构完全一致，这就提示它们发挥的功温振荡培养过夜，取1．5mL培养物置离心管中，12 能可能具有相似性。 r／rain离心2min，收集菌体沉淀；沸水水浴10min，12 000 本研究应用分子生物学技术，克隆了福氏志贺菌 r／min离心2min。取上清，既为福氏志贺菌基因 2amarA基因，并将marA基因在大肠杆菌中进行了表组DNA，一20℃保存备用。 1．4．