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147
拓扑异构酶Ⅱ抑髓剂salvieine导囊Ⅷ,∞白血病细胞DNA扭伤及对c_Ⅱ那表达的影响
细胞DNA损伤及对c.myc表达的影响
蒙凌华 丁健
salvicine是一种新的二萜醌类化合物,目前正处于临床前开发研究阶段。我们已完成的
胞生长作用可能是细胞DNA发生断裂的结果。
从DNA功能的紊乱到肿瘤细胞发生生长阻滞和(或)细胞死亡其间的信号转导通路仍未
完全明了。以往的研究表明,TOPOII抑制剂如Vm26r2
滞或死亡的信号转导通路密切相关。
DNA的损伤、细胞DNA的损伤是否可逆、DNA断裂是否优先发生在一些对细胞增殖起关键
作用的基因区域(如c-myc),以及损伤时c-myc表达的变化。
材料与方法
的溶剂中,储存液浓度为0.1mol/L,使用时用生理盐水稀释。
2.试荆Hoechst
33258,IVITT和DMSO购自SigmaChemicalCo;M-MLV逆转录酶、RP-
MI-1640培养基和TRLzol
工程公司,其余试剂均为分析级。
5000儡种于96孔板中,同时加入不同浓度受试药物,每一浓度设3个复孔,并设相应浓度的
DMSO对照和不加细胞的空白对照。培养2
h后吸去培养液,用PBS选一次,加入100m的
作者单位:200031上海,中国科学豌上海药物研究所
148 中国癌症研究进展⑤
液(10%SDS、5%异丙醇、12mmol几HCl)温育12--20h;用酶标仪在570nnl处测定每孔的光
密度值(A值)。细胞增殖生长抑制率按下列公式计算:
抑制率=坐嘤瑚×100%
’^对照
4.碱变性试验细胞内DNA总的损伤用碱变性实验检测【6』。处于对数生长期的HL-60
细胞用salvidne或生理盐水作用2
h,收集细胞,用冰预冷的PIES洗一次;再悬浮于冰预冷的
PB8,细胞计数,每一实验条件细胞数为4.5×106。本实验基于对细胞进行一定时间的碱变性
min
胞样品分为3组,每组设有3个复管:①双链DNA对照,不经过碱变性处理;②细胞经过30
的碱变性处理;③全部单链DNA,在碱变性处理之前,细胞经过超声破碎处理。F值按下列公式
7
计算:
7 F一照墅堡旦垒坠二堕壁£坠坠
-一 ”双链DNA一单链DNA
5.DNA损伤的修复和DNA再次断裂试验10岫10l/L
离心去掉药物,用PBS洗一次;再用新鲜培养液继续分别培养30min,1h、2h、3h、6h。然后
测F值和提取细胞DNA,DNA样品于1.5%琼脂糖电泳。.
salvidne作用HL-60细胞30nfin后,用
6.PCR-Stop测定分别用1,5,10,50pmol/L
PBS洗一次;并重新悬浮于100m裂解液(50
Triton
x.100,0.45%,Tween-20,0.06mg/ml h。100009离心
proteinaseK)中,于50℃温育2
bp片
37末端213
另一引物扩增c-myc
KCl,10
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