拓扑异构酶Ⅱ抑制剂salvicine导致HL-60白血病细胞DNA损伤和对c-myc表达的影响.pdfVIP

147 拓扑异构酶Ⅱ抑髓剂salvieine导囊Ⅷ，∞白血病细胞DNA扭伤及对c_Ⅱ那表达的影响 细胞DNA损伤及对c．myc表达的影响 蒙凌华 丁健 salvicine是一种新的二萜醌类化合物，目前正处于临床前开发研究阶段。我们已完成的 胞生长作用可能是细胞DNA发生断裂的结果。 从DNA功能的紊乱到肿瘤细胞发生生长阻滞和(或)细胞死亡其间的信号转导通路仍未 完全明了。以往的研究表明，TOPOII抑制剂如Vm26r2 滞或死亡的信号转导通路密切相关。 DNA的损伤、细胞DNA的损伤是否可逆、DNA断裂是否优先发生在一些对细胞增殖起关键 作用的基因区域(如c-myc)，以及损伤时c-myc表达的变化。 材料与方法 的溶剂中，储存液浓度为0．1mol／L，使用时用生理盐水稀释。 2．试荆Hoechst 33258，IVITT和DMSO购自SigmaChemicalCo；M-MLV逆转录酶、RP- MI-1640培养基和TRLzol 工程公司，其余试剂均为分析级。 5000儡种于96孔板中，同时加入不同浓度受试药物，每一浓度设3个复孔，并设相应浓度的 DMSO对照和不加细胞的空白对照。培养2 h后吸去培养液，用PBS选一次，加入100m的 作者单位：200031上海，中国科学豌上海药物研究所 148 中国癌症研究进展⑤ 液(10％SDS、5％异丙醇、12mmol几HCl)温育12--20h；用酶标仪在570nnl处测定每孔的光 密度值(A值)。细胞增殖生长抑制率按下列公式计算： 抑制率=坐嘤瑚×100％ ’^对照 4．碱变性试验细胞内DNA总的损伤用碱变性实验检测【6』。处于对数生长期的HL-60 细胞用salvidne或生理盐水作用2 h，收集细胞，用冰预冷的PIES洗一次；再悬浮于冰预冷的 PB8，细胞计数，每一实验条件细胞数为4．5×106。本实验基于对细胞进行一定时间的碱变性 min 胞样品分为3组，每组设有3个复管：①双链DNA对照，不经过碱变性处理；②细胞经过30 的碱变性处理；③全部单链DNA，在碱变性处理之前，细胞经过超声破碎处理。F值按下列公式 7 计算： 7 F一照墅堡旦垒坠二堕壁￡坠坠 -一 ”双链DNA一单链DNA 5．DNA损伤的修复和DNA再次断裂试验10岫10l／L 离心去掉药物，用PBS洗一次；再用新鲜培养液继续分别培养30min，1h、2h、3h、6h。然后 测F值和提取细胞DNA，DNA样品于1．5％琼脂糖电泳。． salvidne作用HL-60细胞30nfin后，用 6．PCR-Stop测定分别用1，5，10，50pmol／L PBS洗一次；并重新悬浮于100m裂解液(50 Triton x．100，0．45％,Tween-20，0．06mg／ml h。100009离心 proteinaseK)中，于50℃温育2 bp片 37末端213 另一引物扩增c-myc KCl，10