外源基因在乳酸菌中的表达和修饰.pdfVIP

2009’全国益生菌与健康及应用技术交流研讨会 外源基因在乳酸菌中的表达与修饰 姜德洲李瑞青轩辕铮铮苏俊杰徐海津白艳玲张秀明乔明强‘ (南开大学生命科学学院天津300071) 摘要：利用益生乳酸菌表达外源基因已成为当前生物学研究的热点。nisin是一种对人体无害的 抗菌素，可以作为食品级表达载体的筛选标记。此外，利用nisin翻译后修饰系统对生物活性多肽 进行修饰可提高其稳定性。本文对乳酸菌的表达系统和修饰系统进行了综述，并涉及到了本实验室 对功能蛋白进行稳定性修饰的研究。 关键词：乳酸菌表达系统； nisin翻译后修饰系统；外源基因；表达 -JLL‘。■一 刖吾： 乳酸菌是一类能将糖类物质发酵成乳酸的革兰氏阳性细菌。目前至少涵盖18个属，共有两百多 种。绝人多数乳酸菌在人体内具有重要的生理功能，其中以肠道乳酸菌居多。目前国内外生物学家 证实肠道中的乳酸菌与人体的健康长寿有密切的关系。一些乳酸乳球菌可以产生名为细菌素的抗菌 物质，比如nisin，它是一种天然的食品级多肽活性物质，具有防腐和抑菌功能，被广泛应用于生 物食品防腐剂。 近十年来，乳酸菌遗传学方面的研究取得了巨大的进展，推动了乳酸菌表达系统的发展和应用。 截至目前，应用乳酸菌表达系统已经成功表达了多种外源基冈，比如成功表达对人类疾病具有治疗 效果的蛋白分子米作为口服约物，如融合胰岛素、干扰素等，以及应用于口服疫苗的研究。载体构 建和转化技术的进步积极促进了乳酸菌表达系统的发展。此外，对nisin翻译后修饰系统的研究带 动了一个新领域的发展。由于该修饰系统具有将含有丝氨酸和苏氨酸的多肽类分子脱水、环化形成 硫醚环的功能，故可以利用它对一些功能蛋白进行修饰以提高其生物学稳定性。 本文对当前乳酸菌的表达和修饰系统进行了系统介绍，并简要概述了本实验室利用该表达修饰 系统取得的最新研究进展。 1乳酸菌表达系统的宿主菌 属的部分菌种，由于乳酸菌的基因组小，而且许多重要的功能性物质是由染色体外的质粒编码，所 以经改造没有任何质粒的菌株基本上不表达任何自己的蛋白，这就很适合外源基因的表达…。目前 菌，它们都属于无质粒的蜜二糖营养缺陷型菌株嵋1。此外，它们的衍生菌株，如MGl363的衍生菌株 和刀j鲋基因¨’引。这是nisin诱导表达的二组分调控系统所必需的两种调节元件。 2外源基因的表达 近些年来利用乳酸菌表达系统表达外源基因的研究已经取得了长足发展，例如成功表达了人干 ofhuman 扰素B(INF—B)151，人HPv一16E7蛋白(E7oncoprotein 白细胞介素等多种外源基因。利用乳酸菌表达外源基因包含以下三个步骤：构建含有外源基因的表 达载体；将携带外源基因的表达载体转入乳酸菌；转化子的筛选和鉴定。 2．1载体构建 ‘通讯作者：乔明强，南开大学教授，博士生导师． Email：堡也四i垫ggi垒Q@Y坐鲤：￡勉4：堕 联系电话：02223503340地址：天津市南开大学生命科学学院新生物楼301室 教育部新世纪优秀人才支持计划资助。NCEnD鲫212 160 2009’全国益生菌与健康及应用技术交流研讨会 目前存在多种类型的乳酸菌表达系统，主要有乳糖诱导表达系统、术糖诱导表达系统、噬菌体 表达系统(nisin—contr011ed 性，如AIIlpr，cm。和Ery7等。由于抗生素对人体肠道的正常菌群有破坏作用，影响人的健康，故最近 几年都致力于食品级表达载体的构建和研究。已成功用于乳酸菌表达系统的食品级筛选标记有，acR 无义抑制基因、免疫基因、荧光蛋白基因和细菌素抗性等。nisin是一种公认的对人体无害的生物 抗菌素，利用其抗性基因如刀，盯，刀鲫等作为筛选标记可以避免抗生素抗性标记的缺点，为当前食 品级载体构建常用的元件。此外，nisin启动子PnisA也是构建诱导型食品级表达载体常用的元件。 该启动子可受nisin诱导，并且在一定范围内诱导量与nisin浓度成正比。 抗性基因刀s儡该基冈位于质粒上，能够分泌表达切割nisin的基因产物进而对nisin产生抗性。 利用刀媚基冈，本实验室构建了pNSR系列表达载体。 2．2目的蛋白的定位 外源基冈的表达产物可以是溶解在细胞质里，也可以是分泌到细胞外，或者锚定在细胞表面。 toxin