DNA琼脂糖凝胶电泳原理.docVIP

琼脂糖凝胶电泳进行DNA/RNA定量原理DNA（RNA）定量 分析可用紫外光谱分析，原理是DNA（RNA）分子在260 nm处有特异的紫外吸收峰，且吸收强度与DNA(RNA)的浓度成正比。此外，还可通过琼脂糖凝胶电泳上显示的DNA（RNA）带的亮度来分析，因为EB 作为一种荧光染料，能插入DNA(RNA)的碱基对平面之间而结合于其上，在紫外光的激发下产生荧光，DNA(RNA)分子上EB的量与DNA分子的长度 和数量成正比。在电泳时加入已知浓度的DNA（RNA）Marker作为DNA（RNA）分子量及浓度的参考，样品DNA(RNA)的荧光强度就可以大致 表示DNA（RNA）量的多少。这种方法的优点是简便易行，可结合琼脂糖凝胶电泳分析DNA(RNA)样品的完整性来进行，缺点是不太准。 琼脂糖凝胶的配制 　　根据所需凝胶的浓度秤取琼脂糖，加入相应电泳缓冲液中，用微波炉加热煮沸至琼脂糖完全溶解，加入适量?EB?混匀，适当冷却后倾入凝胶铸槽中，插入梳子，凝胶厚度不超过梳孔，如有气泡产生则用玻璃棒驱除，不能过早拔除梳子，应待凝胶完全凝结后才能拔除梳子。 3．P1、P2、P3的配制P1?的配制：在?800ml?去离子水中溶入?Tris?碱?6.06g，Na2EDTA?2H2O?3.72g，用?HCl?调整?pH?至?8.0，用去离子水调整容积至1升，每升P1内加入RNaseA100mg。 P2?的配制：在?950ml?去离子水中溶入?NaOH?8.0g，20％SDS?50ml，调整容积至?1?升。 P3?的配制：在?500ml?去离子水中溶入醋酸钾?294.5g，用冰醋酸调整?pH?值至?5.5，用去离子水调整容积至1升。 4．常用缓冲液： TE pH?7.4 10mmol/LTris?Cl?（pH7.4） 1mmol/L?EDTA（pH8.0） pH?7.6 10mmol/LTris?Cl?（pH7.6） 1mmol/L?EDTA（pH8.0） pH?8.0 10mmol/LTris?Cl?（pH8.0） 1mmol/L?EDTA（pH8.0） STE（亦称?TEN） 0.1mmol/L?NaCl 10mmol/LTris?Cl?（pH8.0） 1mmol/L?EDTA（pH8.0） STET 0.1mmol/L?NaCl 10mmol/LTris?Cl?（pH8.0） 1mmol/L?EDTA（pH8.0） 5%Triton?X-100 TNT 10mmol/LTris?Cl?（pH8.0） 150mmol/L?NaCl 0.05%?Tween?20 电泳缓冲液 Tris-乙酸（TAE）：50×浓贮存液（每升）：242g?Tris?碱 5???7.1ml?冰乙酸 100ml?0.5mmol/L?EDTA（pH8.0） 使用时再稀释50倍。 Tris-磷酸（TPE）：10×浓贮存液（每升）：108g?Tris?碱 15.5ml?85％磷酸（1.679g?/ml） 40ml?0.5mmol/L?EDTA（pH8.0） 使用时再稀释10倍。 Tris-硼酸（TBE）：5×浓贮存液（每升）：54g?Tris?碱 27.5g?硼酸20ml?0.5mmol/L?EDTA（pH8.0） 使用时再稀释10倍。 碱性缓冲液：1×使用液（每升）：5ml10mol/L?NaOH 2ml?0.5mmol/L?EDTA（pH8.0） Tris-甘氨酸：5×浓贮存液（每升）：15.1g?Tris?碱 94g?甘氨酸（电泳级）（pH8.3） 50ml?10%SDS（电泳级） 2×SDS?凝胶加样缓冲液 100mmol/L?Tris?HCl（pH6.8） 200mmol/L?二硫苏糖醇（DTT） 4%SDS（电泳级） 0.2％溴酚蓝 20％甘油 30％丙烯酰胺： 将29g?丙烯酰胺和1gN,N’－亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为60ml的水中，加热至37℃溶解之，补加 水至终体积为100ml。用Nalgene滤器（0.45孔径）过滤除菌查证该溶液的pH值应不大于7.0，置棕色瓶中 保存于室温。 10mol/L?乙酸铵： 把770g?乙酸铵溶解于800ml水中，加水定容至1L后过滤除菌。 1mol/LCaCl2： 在200ml纯水中（Milli-Q水或相当级别的水）溶解54gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成10ml小份贮存于－20℃。 2.5mol/LCaCl2： 在20ml蒸馏水中溶解13.5gCaCl2?6H2O，用0.22滤器过滤除菌，分装成1ml小份贮存于－20℃。 1mol/L?二硫苏糖醇（DTT）