鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断方法建立与应用.pdfVIP

第五届南京农业大学畜牧兽医学术年会论文集 鸡传染性喉气管炎病毒PCR诊断方法的建立与应用 李兆龙1’2，程晓霞1，一，朱小丽1，一，王劭1，一，陈仕龙1t一，林锋强1”，陈少莺1’2 (1．福建省农业科学院畜牧兽医研究所，福建福州3500135 2．福建省畜禽疫病防治工程技术研究中心，福建福州350013) ILl．、，TK基因的PcR方法。应用该方法能从临床分离毒株和疫苗株中扩增到长为427bp的目的片段；但不能从新城疫病毒(NDV)、传染性法氏 以及金黄色葡萄球菌等病原中扩增出阳性条带；敏感性试验表明其DNA最小检出量为4．9rIg；应用该方法和病毒分离法对2份临床病例和人工感 染鸡的检测，两者符合率为100％。上述结果表明该PcR方法具有良好的特异性和敏感性，可用于传染性喉气管炎病毒鉴定和l临床诊断。 关键词：传染性喉气管炎病毒；TK；PcR 鸡传染性喉气管炎(infectiouslaryngotracheitis，匀浆后加入双抗离心取上清液，按照DNA提取试剂 ILT)，是由疱疹病毒科疱疹病毒甲亚科的传染性喉盒说明书进行DNA的提取。 1．3．3 PCR反应条件的优化 气管炎病毒(infectiouslaryngotEacheitisvims，ILlV) 引起的鸡的一种高度传染性呼吸道疾病[1】。该病的 以IUV疫苗株DNA为模板，对所用的反应温 主要病变在喉头和气管组织，临床特征为呼吸困难、 度、反应时间及循环次数进行优化，筛选出最佳的 咳嗽、气喘、咳出带血黏液心】。该病在临床上易与 PCR反应模式。 1．3．4回收纯化的PCR产物测序 其他病毒引起的疾病如传染性支气管炎病毒(infec— ti叽sbronchitis vims，lBV)、新城疫病毒(newc鹊de将回收纯化的PCR产物送大连宝生生物公司有 disea∞vims，NDV)以及H5、H9亚型禽流感病毒限公司进行序列测定。 1．4 (撕粕iIlfluenzavims，AIV)等相混淆，给临床诊断 PCR方法的敏感性、特异性和重复性 带来一定的困难。 1．4．1 PCR的敏感性测定 本研究在传染性喉气管炎病原分离的基础上口J， 在优化的PCR反应条件下，将模板DNA定量 建立了特异、敏感的PCR诊断方法，并与病毒分离 后，以10倍递增稀释的溶液为模板进行PCR扩增。 进行了比较，现将结果报道如下。 1．4．2 PCR特异性测定 在优化的PCR反应条件下，以IuV活疫苗株、 1材料与方法 1．1病毒与试验动物 ILlⅣ活疫苗株购自西班牙B10疫苗公司，IUV扩增。 1．5 福建分离株(IuV—FJ)和2份自然发病鸡的组织样PCR方法的应用 品，由本实验室提供。 1．5．1疑似临床样品的PCR检测 1．2酶及其他试剂 收集来源于福建晋江某蛋鸡场有呼吸道症状的病 料样品或含痘斑的鸡胚绒毛尿囊膜，匀浆后离心取上 Z硇酶、DNA纯化试剂盒等购自TaKaRa大连宝 生生物公司，引物合成及测序在TaKaRa公司。 清液，提取DNA，在优化的PCR反应条件下进行 1．3 PCR方法的建立 检测。 1．3．1 引物设计与合成 1．5．2人工感染发病鸡的PCR检测 取ILlⅣ的尿囊液0．2 利用Premier5．0软件，根据GenB粕k中IuV