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烯脂酰CoA水合酶的原核表达以及纯化 王煜涵，贾保磊，李健，张世宏‘ (吉林大学植物科学学院，吉林长春130062) 摘要：烯脂酰CoA水合酶(Enoyl．CoAhydratase，ECH)作为脂肪酸p一氧化途径的关键酶，参 与脂肪酸分解供能、植物生长代谢和逆境应答信号的系统发育。在调控稻瘟茵致病性方面。p-氧化 途径以及其代谢终产物乙酰CoA对于附着孢的生长发育和侵染植物是必须的。本研究将从稻瘟茵 中克隆ECH，进行原核表达以及纯化，目的为进一步研究ECH所介导的脂肪酸p氧化途径对模式 病原真菌稻瘟菌侵染植物的影响以及抵抗逆境胁迫的能力。这不仅为病害的防治提供理论基础，同 时也为其它病原真茵的研究提供新的科学依据。 关键词：烯脂酰CoA水合酶；脂肪酸p氧化；原核表达；稻瘟茵 由稻瘟病菌(Magnaportheoryzae)引起的稻瘟病是水稻上危害最为严重的真菌病害之 一，每年都给水稻生产带来重大的经济损失【11。稻瘟菌作为一种模式病原真菌，对其侵染机制 以及抵抗逆境胁迫的研究是至关重要的，这不仅为病害的防治提供理论基础，同时也为其它病 原真菌的研究提供新的科学依据。 烯脂酰CoA水合酶(Enoyl．CoA 双键上进行立体异构的加水，形成L．(+)．B．羟脂酰CoA【2】。p．氧化途径作为生物体内脂肪酸 氧化分解的主要途径，最终生成乙酰CoA，同时氧化还原过程中生成的电子进入呼吸链参与 能量的生成【31。脂肪酸B．氧化是脂肪分解供能的主要途径，尤其在主要能量来源葡萄糖缺少的 条件F。植物界的B一氧化途径，不仅存在于脂肪酸的分解代谢和脂质代谢中，也存在于植物激 素和氨基酸的代谢中，同时p．氧化途径在植物信号系统发育，尤其是茉莉酸的生物合成中起着 重要作用。荣莉酸作为高等植物中的生长调节物质，参与调节植物的生长发育和环境胁迫应答。 途径的终产物乙酰CoA对于稻瘟菌侵染植物是必需的，增强稻瘟菌对植物的致病性。所以ECH 参与的脂肪酸p一氧化途径，对于稻瘟菌侵染植物、植物信号系统发育以及参与环境胁迫应答 等方面起着重要的作用。 本研究将从稻瘟菌中克隆ECH，进行原核表达以及纯化，目的为进一步研究ECH所介导 的脂肪酸B一氧化途径对稻瘟菌附着孢的生长发育、侵染能力以及抵抗逆境胁迫的影响。 1结果与分析 1．1 ECH的克隆以及原核表达载体的构建 grisea 通过NCBI和Magnaporthe ’通讯作者。 43 M M M：DNAMmker 12：PcR扩增目的条带M：DNAMarker 2,3：双酶切重组质粒 图I ECHPCR扩增电泳图 图2双酶切鉴定重组质粒电泳图 I和Xho 片段(图1)。用EcoR 正确后，将重组质粒命名为pET-ECH。 1．2融合蛋白的表达 没有增粗的条带，说明融合蛋白未表达；经口TG诱导的细菌，其总蛋白在35KD左右处有 一条明显增粗的带，为6*HisTag．ECH融合蛋白，说明融合蛋白得到了表达(图3)。 9 M 1：不经口町．G诱导的对照组 i 黼 2：经IPl’G诱导后的融合蛋白 3：超声破碎后取上清 辫!4：超声破碎后取沉淀 燃瑟一