生物技术制药第 4章.pptVIP

第四章 抗体制药 第一节 概述 抗体是能与相应抗原特异性结合的具有免疫功能的球蛋白。 它是机体免疫系统受到抗原物质刺激后，B淋巴细胞被活化、增殖和分化为浆细胞，由浆细胞合成和分泌的球蛋白。 第二节 单克隆抗体 单克隆抗体是将抗体产生细胞与具有无限增殖能力的骨髓瘤细胞相融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而产生的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是由单一的B淋巴细胞克隆产生的，所以称为单克隆抗体。 单克隆抗体和多克隆抗体 一、免疫学知识 人体和动物都有免疫系统，包括特异性免疫和非特异性免疫，其中特异性免疫又分为体液免疫和细胞免疫。 非特异性免疫 宿主的屏障; 吞噬细胞; 正常组织和体液中的抗菌物质; 炎症反应. 不直接杀死病原体，但能配合免疫细胞、抗体或其他防御因子使它们发挥较强的免疫功能，如补体、干扰素。 二、抗原与动物免疫 免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，所以一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。常用的骨髓瘤品系来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，免疫动物也采用相应的品系。 三、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 用于细胞融合的骨髓瘤细胞应具备： 融合率高； 自身不分泌抗体； 所产生的杂交瘤细胞分泌抗体的能力强且长期稳定。 聚乙二醇的性质 聚乙二醇的相对分子量和浓度越大，促融合率越高，但黏度和对细胞的毒性也随着增大。 可用范围：分子量400-6000，浓度10%-60%。 最适范围：分子量4000，浓度40%-50%。 融合结果 产生了脾-脾、瘤-瘤、脾-瘤融合细胞。为获得目的细胞将融合后的细胞立即转入选择性培养基中，常用HAT培养基,是用次黄嘌呤、氨基喋呤和胸腺嘧啶配成。氨基喋呤能阻断DNA合成的主要途径，瘤-瘤融合细胞和瘤细胞因不能合成DNA而死亡。脾-脾融合细胞在培养几天后也会死亡，而杂交瘤细胞则可以存活。 培养方法 将融合的细胞悬浮于HAT培养基中，加入到96孔板内，根据情况2-3天换液一次，每次吸去二分之一到三分之二培养液，再加入等量新鲜培养液。7-14天改用HT培养液，14天以后用普通的RPMI1640完全培养液。因为杂交瘤数量很少，多半不易存活，所以统通常要加入饲养细胞才能使其繁殖，常用小鼠腹腔巨噬细胞、脾细胞和胸腺细胞。饲养细胞的作用：能释放某些生长刺激因子，并能满足杂交瘤细胞对细胞密度的依赖性。 单抗制备过程图解 四、筛选阳性克隆与克隆化 对于最后存活的细胞我们要进行筛选，看其是否是我们想要得到的能产生单克隆抗体的融合细胞，筛选方法应微量、快速、特异、敏感、简便并能一次检测大批标本。 常用方法 免疫酶技术、免疫荧光技术、放射免疫技术。免疫酶技术因为不需要进行放射性标记，操作简便，又适用于大批标本的检测，广泛采用，通过引入生物素-亲和素等放大系统可进一步提高灵敏度。免疫酶技术、放射免疫技术适用于可溶性抗原和颗粒性抗原的抗体检测，免疫荧光技术适用于细胞抗原的抗体检测。 酶联免疫吸附试验（ELISA） 五、杂交瘤细胞与抗体性状的检定 正常鼠脾细胞的染色体数是40，小鼠骨髓瘤细胞的染色体数大于40，如54-64，62-68。染色体数目较多又比较集中的杂交瘤细胞能分泌高效价的抗体。 六、单克隆抗体的大量制备 体外培养法和体内诱生法多用后者。方法：在接种前1-2周，先给小鼠腹腔注射0.5毫升的降植烷（或液体石蜡），然后接种1×106杂交瘤细胞，待生成腹水后再抽取，离心去细胞沉淀，取上清夜冻存。 体内诱生法的缺点 小鼠腹水中含有多种来自小鼠的杂蛋白，给纯化带来很大的难度。 七、单克隆抗体的纯化 先明确单克隆抗体的免疫球蛋白的类和亚类，并根据用途综合选定纯化方法。用于体外诊断试剂，IgG采用沉淀处理结合亲和层析，IgM沉淀处理结合凝胶过滤。体内诊断试剂或治疗用药，应去除内毒素、核酸、病毒等微量的污染，必须经亲和层析和阴离子交换层析。 体内诱生的单克隆抗体的纯化： 1、澄清和沉淀处理：先低速离心5分钟，去除沉淀，再高速离心30分，去除残留的小颗粒物质，再用0.2微米的微孔滤膜过滤，除去污染的细菌、支原体和脂质，用饱和硫酸铵沉淀抗体。 2、分离：凝胶过滤、阴离子交换层析、亲和层析。 第三节 鼠源性单克隆抗体的改造 最初制备的单克隆抗体都是鼠源性的，大量应用于人体时可产生人抗鼠抗体，使其作用和效果都受到严重影响，甚至有毒副作用。 改造目的 改造鼠源性单克隆抗体的目的有两个： 1、一是降低免疫原性； 2、二是降低相对分子量，增加组织穿透能力。 一、人-鼠嵌合抗体 抗体同抗原结合的功能取决于抗体分子的可变区，同种性免疫原性则决定于抗体分子的稳定区。 人-鼠嵌合抗体：鼠源性单克隆抗体的可变区基因和人免疫球蛋白的稳定区基因连接起来，再共转染骨髓瘤细