生物技术制药-03抗体制药.pptVIP

生物技术制药 第四章 抗体制药 第四章 抗体制药 第一节 概述 第二节 单克隆抗体 第三节 基因工程抗体 第四节 抗体工程 第五节 抗体诊断试剂 第六节 抗体治疗药物 第一节 概述 单克隆抗体的应用 用于疾病的诊断和治疗：如利用单克隆抗体检测与某些疾病相关的抗原，辅助临床诊断，或用放射性核素标记 单克隆抗体进行肿瘤显像，进行免疫鉴定。用于临床治疗，如针对T淋巴细胞共有的分化抗原CD3的单克隆抗体，用作免疫抑制剂。 单克隆抗体还可作为载体制备导向药物。但是要解决以下两个问题：（1）鼠源性单克隆抗体的免疫原性；（2）完整的抗体分子分子量过大，难以穿透实体肿瘤组织，达不到有效的治疗浓度。 单克隆抗体的应用 基因工程技术为解决这两个问题提供了可能。 已通过基因工程技术，制备出改形抗体、单链抗体、单域抗体、最小识别单位等很多类型的抗体或抗体单位。基本消除了单克隆抗体的鼠源性，相对分子质量只有完整抗体分子的1/80~1/3，而且鼠源性单克隆抗体的生物学活性如激活补体、促进吞噬功能（免疫调理）、抗体依赖细胞介导的细胞毒作用等，只保留同抗原特异性结合的活性。 二、细胞融合技术背景知识 1958年，冈田善雄发现紫外灭活得仙台病毒可引起艾式腹水瘤细胞融合。 1964年，Little-field用A3-1细胞和B34细胞融合，并采用HAT培养基，将杂种细胞筛选出来。 细胞融合技术（体细胞杂交）：将两个不同种类的细胞，用化学的、生物的或物理学的方法，使它们彼此融合在一起，从而产生出兼有两个亲本遗传性状的细胞，其实质是无性杂交。 第二节 单克隆抗体 单克隆抗体是将抗体产生细胞与骨髓瘤细胞融合，通过有限稀释法及克隆化使杂交瘤细胞成为纯一的单克隆细胞系而生产的。由于这种抗体是针对一个抗原决定簇的抗体，又是单一的B淋巴细胞克隆产生的，因此称为单克隆抗体。它是结构和特异性完全相同的高纯度抗体。制备的一般流程见下图。 单克隆抗体和多克隆抗体的制备 第二节 单克隆抗体 一、抗原与动物免疫 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 三、筛选阳性克隆与克隆化 四、杂交瘤细胞与抗体性状的鉴定 五、单克隆抗体的大量制备 六、单克隆抗体的纯化 一、抗原与动物免疫 （1）制备用于动物免疫的适当抗原。 化学合成抗原，如精制的地高辛。 多数情况下抗原物质只能得到部分纯化，甚至是极不纯的混合物，如部分纯化的干扰素。 通过克隆化选出最适当的单克隆抗体。 在制备恶性肿瘤细胞表面抗原的单克隆抗体时，情况较复杂，需用整个肿瘤细胞做为免疫原，经过筛选、克隆化，制备出仅存在于肿瘤细胞而不存在于正常细胞上的表面标志分子上的单克隆抗体。 一、抗原与动物免疫 （2）稳定的杂交瘤的获得 因免疫动物品系和骨髓瘤细胞在种系发生上距离越远，产生的杂交瘤越不稳定，故一般采用与骨髓瘤供体同一品系的动物进行免疫。目前常用的骨髓瘤细胞系多来自BALB/c小鼠和Lou大鼠，因此免疫动物也多采用相应的品系，最常用的也是BALB/c小鼠。 选择动物时应考虑到动物品系的免疫应答基因（Ir）对抗原免疫应答的影响。不同品系的小鼠与大鼠在对某类抗原的免疫应答上是不同的。书中表4-1是骨髓瘤细胞系一览表，可以参考。 一、抗原与动物免疫 （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 体内免疫法：适用于免疫原性强、抗原量较多时应用，一般用8~12周龄的雌性鼠。颗粒性抗原（如细菌、细胞抗原）的免疫原性强，可不加佐剂，直接注入腹腔107个细胞进行初次免疫，间隔1~3周，再追加免疫1~2次，可溶性抗原则按每只小鼠10~100?g抗原与福氏完全佐剂等量混合后注入腹腔内，进行初次免疫，间隔2~4周，再用不加佐剂的原抗原追加免疫1~2次。一般在采集脾细胞前3日由静脉注射最后一次抗原，其目的是使对应的B淋巴细胞克隆受到可靠的最大限度的刺激，使其迅速地增殖分裂，因为细胞融合后增殖最好的细胞是迅速分裂的细胞。有人认为在常规免疫的基础上用脾内免疫法做追加免疫较佳。 一、抗原与动物免疫 （3）免疫方法：体内免疫法和体外免疫法 体外免疫法：用于不能采用体内免疫法的情况下，如制备人源性单克隆抗体，或者抗原的免疫原性极弱且能引起免疫抑制时使用。 体外免疫法所需要的抗原量少，一般只需几个?g，免疫期短，仅4~5天，干扰因素少，已成功制备出针对多种抗原的单克隆抗体，但融合后产生的杂交瘤细胞株不够稳定。其基本方法是用4~8周龄BALB/c小鼠的脾脏制成单个细胞悬液，再加入适当抗原使其浓度达0.5~5 ?g/ml，在5%CO2、37℃下培养4~5天，再分离脾脏细胞，进行细胞融合。 二、细胞融合与杂交瘤细胞的选择性培养 （1）细胞融合基本方法：取适量脾细胞（1×108）与骨髓瘤细胞（2 ×107 ~3×107）进行混合，在聚乙二醇（PEG）作用下诱导它们融合，时间控制在2m