志贺毒素弱毒突变体及大肠杆菌O157重组弱毒菌株的构建.pdfVIP

中国畜牧善医学会动物传染病学分会第十=次学术研讨会 志贺毒素弱毒突变体及大肠杆菌0157重组弱毒菌株的构建 捌军韩洋祝夸伟郭擘羊齐种用博冯书幸 (军事医学科学魔军事善匮研究所．长春吉球，130嘶2) 擅要肠出血性太脯杆茵0157：H了感染是重要的新发食物霹性传染囊。主要引起耍幼儿腹泻、出血性蛄 髓夷和溶血性尿路综奢症等．毒曹毒索是腑出血性太肺杆茵0157：H7囊重要的毒力囡子之一．同时也是最 重要的抗原之一．拳研充利用基固工程的方法．将蝙码s戗lA和呶2A亚基的毒性活性中心和跨膜区的基 因序列进行定点突变．主要突变位点包括s叫毒性活性区|5167位的谷氧酸突变成天冬氨酸(E167D)，第 活性区和跨膜区同时突变的s鲥和铀c2突变体基固克隆到pucl8质拄中，构建重妞质杜pslxI．3·sTX2．3， 将重蛆质牲转八太腑杆菌DH铀中进行表迭．并刺用vc∞细胞．对这些不同的s执突变体的细胞毒性进行 研究．蛄秉琦膜区定点突变后sb吐的毒性有一定下降。而对s戗l的毒性无明显影响．毒性活性区定点吏变 后，s臼cl和sb【2的毒性都明显降低．毒性活性区和琦腱区同时突变后，socl和sDc2的毒性都已降低．s臼【l 毒．睦降低了妁lo∞倍．而sb吐的毒性已基本消除．重组质牲口slxl．3．sTx2．3中带有毒性活性区和跨镬区 同时突变的Shl和s衄2突变体基因，将谊重组质粒转八0157：H7基因缺失突变菌株F25．导八重组质牲 后的重组菌株．一方面主要毒力基因(sD‘l和s臼c2)和毒力因子调控基固(h)都已缺失，细茼的致病性 巴基本消除，另一方面又导入了毒性已消除或降低的s吼l和s臼【2突变体基固，谊茸株又具有s臼【的免疫原 性．因此从理论上分析．谊菌株的免疫原性将比F25更好．奉研究为构建EHEcOl57：H7基固工程弱毒疫 苗茵株奠定了基础． 关键词腑出血性大脑杆菌．志贺毒素．变变．弱毒疫苗 志贺毒素(Sh逸ato越ll，S饮)是肠出血性大肠杆菌0157：H7最重要的毒力因子之一，S戗 是由整合到细菌基因组上的原噬菌体编码。有研究表明．0157：H7引起血性结肠炎(HC) 和溶血性尿毒综合症(删S)的主要原因就是由于能产生志贺毒索【lJ．S臼‘主要包括两个没 有血清学交叉反应的群：s戗l和sb【2，它们分别由整合到细菌基因组上的两个不同原噬菌 噬菌体933w所编码。S戗全毒素是由一个A亚基和5个相同的B亚基组成，A亚基又可分 过阻断靶细胞蛋白质的合成，从而杀死靶细胞。Al通过A2与B亚基连接，B亚基是结合 亚基，能够与靶细胞表面的Gb3受体结合．从而引导A亚基进入靶细胞内。但B亚基本身 并没有毒性作用【21。 由于S戗是0157：H7最重要的毒力因子之一。也是引起HC和HUS的主要因素，因此， 人们对S戗的结构、序列特征和作用机理进行了大量研究．尤其是对S执在0157：H7致病和 免疫中的作用进行了研究．大量研究证实，S钒的B亚基具有较好的免疫原性．在0157：}17 的疫苗研究中，许多研究人员都曾利用sbcB作为主要的抗原之一来开发疫苗．并产生了一 定的免疫效果．但是，单以sD国免疫后，并不足以刺激机体产生针对志贺毒素的完全保护 性作用。同时。有研究表明S戗的A亚基也具有很好的免疫原性，但由于A亚基是毒性亚 基。不能直接作为抗原用于构建疫苗。 本实验室所构建的0157：H7蛔如趣基因缺失突变菌株Ⅲ，由于是消除了编码志贺毒素的 整个原噬菌体序列，S坟的A亚基和B亚基均不能表达，没有s臼【的免疫原性，对单纯志贺 毒素的攻击也就不具有任何保护作用．因此。本实验拟通过基因工程的方法，分别对S臼‘l 和sb盘的A亚基进行定点突变．其目的是使A亚基突变后的s扭丧失毒性作用，保留免疫 原性．而B亚基本身就没有毒性作用。将A亚基突变后的s臼c导入已构建好的0157：H7切如肛 基因缺失突变菌株，从而为构建0157：H7重组基因工程弱毒疫苗奠定基础。 由于痢疾志贺氏菌产生的志贺毒素、出血性大肠杆菌产生的S臼【l和Sb盘，以及蓖麻毒 素等都具有相同的A．5B亚基结构，且功能也非常相似，通过对这几种毒素序列进行比较分 析，发现它们具有两个高度保守的区域。一个位于毒素可能的活性区。另一个位于毒素的跨 膜区。通过对编码这两个保守区域的氨基酸残基的突变，可能会导致毒素毒性的降低或消除， 但保留完全的免疫原性。本研究即是在此基础上，并参考国内外已有的研究结果，分别对 S戗l和s臼【2的A亚基上这两个区域内的序列行定点突变，然后对s戗及其突变体的细胞