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作者姓名：吴侠 论文题目：牛胚胎发育过程组蛋白修饰及克隆胚胎表观遗传重编程的 作者简介：，男，年09月出生，年月师从于大学教授，于年月获博士（硕士）学位。体细胞克隆诞生且体细胞核移植技术已经越过了种属的界限体细胞克隆胚胎怀孕率低、出生后胎儿异常的问题依然没有解决许多研究证实，供体细胞核在受体卵母细胞中的不完全或异常表观遗传重编程是导致克隆胚胎发育异常的重要原因。基因组DNA甲基化、组蛋白的共价修饰是重要的表观遗传修饰，二者具有复杂而广泛的生物学功能正常生殖细胞发生及胚胎发育过程，染色体要经历广泛的DNA甲基化、去甲基化，核小体核心组蛋白也要通过各种共价修饰调节染色体功能，从而完成遗传信息的传递和调控胚胎的发育。为了深入探讨克隆胚胎组蛋白修饰的重编程，进而改善克隆效率，阐明胚胎的发育机理本研究探讨了牛卵母细胞体外成熟、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰的动态变化，比较了体外受精胚胎与克隆胚胎早期发育过程中组蛋白修饰的差异。使用组蛋白乙酰化酶抑制剂对供体细胞及受体卵母细胞进行了处理，检测了药物对供受体表观遗传修饰，克隆胚胎发育的影响，并对处理后供体核在去核卵母细胞中的重编程进行了。1. 牛卵母细胞减数分裂、体外受精及胚胎体外发育过程中组蛋白修饰动态变化本研究探讨了组蛋白H3、H4不同甲基化、乙酰化修饰位点在牛卵母细胞成熟、体外受精及胚胎体外发育不同阶段的动态变化。结果显示，组蛋白H3、H4甲基化，乙酰化具有明显的阶段性变化。牛卵母成熟过程不同组蛋白不同修饰位点经历阶段的，特异性去乙酰化，组蛋白甲基化则在卵母细胞成熟过程中没有明显变化。胚胎发育，乙酰化存在于牛胚胎发育的各个时期组蛋白H3K9ac，H3K18ac在8细胞期明显减弱，桑葚胚增强。H4K8ac，H4K5ac在胚胎发育的不同阶段都具有较强的荧光信号。合子基因组激活前，细胞间期，H4K8ac、H4K5ac定位于细胞核周边有丝分裂期，H4K8ac定位于凝聚染色体末端，H4K5ac信号明显减弱。H3K18ac、H4K8ac、H4K5ac在囊胚滋胚层染色较内细胞团强。组蛋白乙酰化，H3K4me3在合子基因组激活后几乎完全消失，而H3K9me2则明显增强。上述结果表明，卵母细胞成熟有其特异的组蛋白修饰动态转变，组蛋白乙酰化逐渐除；受精是组蛋白逐渐恢复的过程；胚胎发育维持了组蛋白乙酰化、甲基化修饰受精及胚胎发育过程中，相同组蛋白的不同位点有相似的调控模式（H3K9ac vs H3K18ac；H4K8ac vs H4K5ac）；功能相关的不同组蛋白修饰有其类似的动态变化（H3K9ac、H3K18ac vs H3K4me3），并且组蛋白乙酰化在细胞核中的定位与合子基因组激活有关（H4K8ac、H4K5ac）；组蛋白修饰与DNA甲基化密切相关（H3K9ac、H3K18acH3K4me3 vs H3K9me2）。 2. 牛体细胞核移植系统的优化及体外受精与核移植胚胎发育过程组蛋白修饰的比较 本研究建立了成体海福特公牛耳皮肤成纤维细胞系，对其体外生长特性及核型进行了分析体外受精。结果表明成体成纤维细胞具有正常的形态、分裂增殖特性和染色体数目。为了提高重构卵的融合率，显微操作后不同恢复时间，结果恢复0.5hr融合率明显高于恢复1.5hr（73.4% vs 52.7%，P0.01）。利用间接免疫荧光技术比较体外受精和胚胎发育不同阶段组蛋白不同修饰位点乙酰化、甲基化的动态变化供体基因组激活前，克隆胚胎存在明显的组蛋白乙酰化修饰，高水平的H3K9ac、H3K18ac、H4K5ac、H4K8ac、H3K4me3存在于8细胞前发育阶段并且重构胚H4K5、K8ac在细胞核中的定位与体外受精胚胎存在明显差异基因组被激活，除了H3K9me2，克隆胚所有组蛋白乙酰化、甲基化修饰的荧光强度及定位都与体外受精胚胎类似。。 3. TSA处理转基因体细胞对克隆胚胎发育的影响 Trichostatin ATSA）作为特异的组蛋白去乙酰化酶抑制剂，能够增加细胞组蛋白乙酰化水平，激活基因的表达，本研究使用组蛋白TSA处理转基因供体细胞，并对基因组DNA甲基化、组蛋白乙酰化、报告基因表达及克隆胚胎发育进行分析。结果表明转基因供体细胞对TSA存在明显的剂量效应。TSA浓度为100ng/mL时，产生明显的细胞毒性，大量细胞死亡（P0.01）。TSA在较低浓度（5-50ng/mL），细胞形态发生改变，细胞增殖明显抑制，S期细胞明显减少，细胞被抑制于G0/G1期。核型分析显示，TSA处理没有导致转基因细胞异常核型的形成。使用10-50ng/mL TSA处理供体细胞，明显增加了表达报告基因，基因组DNA甲基化水平将低，组蛋白乙酰化水平增加。使用经TSA处理的体细胞作为供体进行核移植，获得了类似的卵裂、桑葚胚及囊胚率。TSA浓度为50ng