酵母蔗糖酶的纯化及性质研究.docVIP

酵母蔗糖酶的纯化及性质研究酶的纯化实验原理蔗糖酶(E.C.3 2.1.26)能催化非还原性双糖(蔗糖)的1，2—糖苷键裂解，释放出等量的果糖和葡萄糖。从式中可以看到，每摩尔蔗糖水解产生两摩尔还原糖，蔗糖的裂解速率可以通过Nelson 法测定还原糖的产生数量来测定。一个酶活力单位规定为为在标准分析条件下每分钟催化底物转化的数量。比活力单位为每毫克蛋白含有的酶活力单位。啤酒醉母中含有丰富的蔗糖酶，本实验以它为原料，通过破碎细胞、热处理、乙醇沉淀柱层析等步骤提取蔗糖酶．并对其性质进行测定。除非特别说明，所有的纯化步骤均在0－4之间进行。(二)仪器和试剂试剂啤酒酵母、甲苯、95％乙醇、DEAE—纤维素、0.05mol/LTris 缓冲液，pH7.3。(三)操作方法1.取20g 干酵母或市售鲜啤酒酵母以2000rpm 离心10分钟后，所得的20克沉淀，加5一10g 细砂，加20m1甲苯，在研钵内磨成糊状。然后每次加10mL 水，研磨10分钟左右、共3次，使其呈糊状。2.将研磨好的内容物转移到50mL 离心管中，平衡后以12000rpm 离心15分钟。3.用吸管小心将离心后的中间水层转移到干净的离心管中，勿带上层甲苯相，然后以12000rpm 离心15分钟。4.将3步离心后的上清液取出，倒人量筒中记录其体积，留下1.5m1作为第一组分粗抽提液以备酶活力测定和蛋白浓