生化实验-血糖的测定.ppt

血糖的测定 临床：血糖检测是目前诊断糖代谢异常相关疾病的主要依据。 科研：在代谢疾病的研究中，常测定血糖。在某些药物的研究中，也涉及血糖的测定。 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法原理 （1）葡萄糖＋O2＋H2O 分光光度计的原理 分光光度计的工作原理 朗伯-比尔定律 朗伯定律：A=k1L 比尔定律：A=k2C 朗伯-比尔定律：如同时考虑液层厚度和溶液浓度对吸光度的影响，则吸光度与溶质的浓度和溶液的厚度的乘积成正比。 A=KLC 朗伯-比尔定律应用 1. 接通电源，调整波长。 2. 比色杯中加入空白及待测样品，并放入分光光度计中，注意：加入样品量不超过比色杯体积的2/3。 3. 调模式为“透射比”，对空白对照进行调“0”（开盖）和调“100”（闭盖）。 4. 调模式为“吸光度”，将空白对照调“0”，测定待测样品的吸光度值。 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测激素对血糖浓度的影响 （1）取4支试管，按下表加入试剂: 补充实验 测2-3名同学早餐后和空腹血糖的水平，并比较二者之间的区别。 使用怡成JPS-5型血糖仪。 小结 1、葡萄糖氧化酶-过氧化物酶比色法测定血糖的原理。 2、分光光度计的正确使用。 3、实验操作中存在的问题。 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶比色法 Folin-Wu法 邻-甲苯胺法 原理 葡萄糖在和碱性铜试剂混合加热后，可使 Cu2+还原成Cu+ ，后者与磷钼酸试剂作用生成蓝色的钼蓝。通过比色法测定蓝色化合物，计算出血糖的含量。 评价 稳定、准确、但对葡萄糖无特异性，受血中非糖还 原物质的影响。 空腹正常血糖参考值 4.4~6.7mmol/L或80-120mg/dL 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶比色法 Folin-Wu法 邻-甲苯胺法 原理 葡萄糖在冰醋酸中加热脱水后，与邻-甲苯胺缩合产生蓝绿色的席弗(Schiff)碱，颜色的深浅与葡萄糖含量成正比，可通过比色法测得血糖含量。 评价 结果较可靠、但邻-甲苯胺须蒸馏后使用，有毒性。 空腹正常血糖参考值 3.9~6.1mmol/L或70-110mg/dL 葡萄糖氧化酶法：该法特异性高，反应条件温和，能反映血中葡萄糖的真实含量，且已推广出试剂盒，广泛应用与临床。 Folin-Wu法：该法对葡萄糖无特异性，一切还原物质均可产生同样的反应。虽血液中葡萄糖为主要还原物质，但仍存在其他非糖还原物质，故该法其参考值较其他方法略高。 邻-甲苯胺法：该法涉及强酸、加热等反应条件，不便于大规模检测，且使用的试剂具有毒性，临床和科研上已很少采用。 思考题 1、为何不同检测方法所提供的空腹正常血糖参考值存在差异？ 葡萄糖氧化酶法： 3.9~6.1mmol/L Folin-Wu法： 4.4~6.7mmol/L 邻-甲苯胺法： 3.9~6.1mmol/L 2、肾上腺素使血糖升高的机理是什么？能够升高血糖的激素有哪些？ * * 实验四 血糖及血糖水平的概念： 血糖：指血液中的单糖：葡萄糖 血糖水平：血浆中葡萄糖浓度 血糖总维持在恒定水平： 3.9~6.7mmol/L 调节血糖水平的激素：胰岛素、胰高血糖素、糖皮质激素和肾上腺素。 血糖水平异常：⑴高血糖及糖尿病；⑵低血糖 测定血糖的意义 体液糖的测定项目： ①血糖浓度测定 ②口服糖耐量试验 ③糖化血红蛋白试验 ④糖化血清白蛋白测定 ⑤胰岛素测定 ⑥C-肽测定等 测定方法 无机化学法： Folin-Wu法 有机化学法：邻甲苯胺法 酶法：葡萄糖氧化酶法 血糖测定的常用方法 （2）H2O2＋4-氨基安替吡啉＋苯酚 葡萄糖酸＋H2O2 葡萄糖氧化酶（GOD） H2O ＋红色醌式物质 过氧化物酶 （POD） Trinder反应 505nm 光吸收法测定 相对血糖浓度 分光光度技术 电泳技术 层析技术 离心技术 生物化学的四大研究技术： 光的波粒二象性 物质的光吸收性 分光光度计的原理 A标=KC标L A样=KC样L 标准品法测定未知样品含量 C样= A样 A标 × C标 分光光度计的使用 方法 3.00 – – 0.02 测定管1(ml) 3.00 3.00 3.00 酶酚混合试剂 0.02 – – 蒸馏水 – – 0.02 葡萄糖标准液 – 0.02 – 血清样品 空白管(ml) 测定管2(ml) 标准管(ml) 试剂 实验步骤： 充分混匀，37℃ 水浴中保温20min； 冷却至室温后，505nm处比色 比色方法：以空白管调零，读取标准管及测定管光密度值。 （2）计算：