PCR技术在突变基因检测中的应用.docVIP

PCR技术在突变基因检测中的应用 基因突变(gene mutation)是遗传病和肿瘤发生的根本原因，检测与遗传病及恶 性肿瘤发生有关的突变基因(mutant gene)是分子生物学，医学遗传学及肿瘤学研究 的热点，它对阐明遗传病和肿瘤发生的分子生物学基础及其诊断和早期诊断具有重要 ＼意义，分子生物学技术的发展，尤其是PCR技术的出现及近年来以PCR技术为基础， 结合传统技术的突变基因分析方法为人们提供了许多快速、简便、准确的基因分析途 径，并取得了令人瞩目的成果. 　　基因突变是癌基因激活，抗癌基因失活及遗传病发生的根本原因，从广义的角度 来看，基因突变包括点突变，染色体突变和基因组突变三种形式，只是它仍所涉及的 范围不同，后两种基因突变涉及的基因较多，可通过光学显微镜分析细胞有丝分裂中 期的染色体而检出.亦可在间期用标记探针检出，点突变通常的涉及的范围较少，它 是肿癌和遗传病发生的主要分子改变，因此，它是基因分析的主要研究内容.不同类 型的基因突变有不同的检测途径，大致方法包括：应用基因探针直接检测；应用PCR 技术检测；利用探针技术进行分析。 PCR在突变基因检测时的应用 　　利用核酸探针及Southern印迹杂交技术进行基因突变分析时由于诸多限制难以满 足这际工作的需要，自从PCR技术问世以来，建立于PCR技术基础上的突变基因检测技 术发展迅速，它不仅能在短时间内检出发生突变的基因，而且即使获得极微量的组织 亦可经PCR扩增而进行中种检测，加上PCR技术与探针杂交技术，RFLP技术及PCR直接 测序的结合，改换方法得以迅速发展和推广，大大的促进了遗传病及肿瘤有关的基因 的研究进展. 一、点突变的PCR直接检出 (一)用PCR直接检测缺失: 　　当基因内缺失时，可用已知的该基因DNA序列在缺失片段的两侧设计一对引物， 然后进行PCR，对其产物行琼糖凝胶电泳，溴乙锭染色，紫外检测仪下检测有无特异 性的扩增产物，即可非常容易的判断待检称本中有无DNA片段的缺失. 　　1.一对引物PCR检测缺失如果一个基因的DNA序列已经清楚，其缺失部位亦较为固 定，即可根据缺失发生区域的DNA序列在缺失片段的两侧合成一对合适的引物进行PCR， 然后琼脂糖凝胶电泳及溴乙锭染色，短波紫外灯下观察有无特异性的扩增片段，该方 法是检测基因片段缺失最为快速的方法，在实际应用中，为了避光因某些原因引起的 扩增失败而导致假阴性结果的出现，常在反应体系中加入一对与缺失片段无关的基因 引物，同时加以扩增，以确定无特异性扩增带并非因反应体系的原因的引起.如在应 用PCR技术进行X地贫Bartα基因胎儿水肿综合征义基因缺失检测时，常用一对引物扩 增缺失区域，同时同一对β基因引物扩增β基因的一个片段，然后电泳检测.若同时 即有α和β基因的特异性扩增产物，则说明α基因的扩增产物则说明模板DNA中有α 基因的缺失，为Bart胎儿水肿综合征. 　　2.多对引物的多重PCR检测缺失：对于某些遗传病的致病基因来说，其缺失具有明显的异质性，即在不同患者其缺 失片段有所不同，因而难以用一对缺失部位的引物将所有的缺失检出，在这种情况 下，我们可设计多对引物检测该基因的不同外显子区域，即用同一PCR体系扩增多个 外显子然后用琼糖凝胶电泳检测有无缺失的片段，若某一特异性的扩增产物带缺如， 则可判定为该片段的缺失，该检测方法是对已知结构基因有无缺失片段的最快速可行 的检测途径，目前已用于多种遗传病基因缺的检测.如在DMD/BMD缺失型突变的检测 中，用23对引物分为三组进行多重PCR可改98%的缺失得以检出，另外还有人用9对物 进行两组多重PCR，大约可检出DMD/BMD92%的缺失型突变. 　　3.用PCR技术进行杂合性丢失的检测：有报道，PCR技术尚可用于检测杂合性丢失可采用PCR-SSCP及PCR定量技术进行检 测. (二)单个碱量置换的PCR直接检出 　　1.直接检测限制性内切酶切点的变化-PCR产物酶解分析 　　PCR产物的酶解分析，主要用于检测可引起酶切位点改变--包括所增加的酶切位 点及原有的酶切点消失的单碱是量置换性点突变.当某一点突变引起DNA片段中酶切位 点发生改变时，则可用酶切位点两侧的引物扩增一含该切点的DNA片段，然后用相应 的内切酶进行处理，电泳检测，与正常的无改变的段进行对片分析即可确定有无酶切 位点的改变.比如状细胞贫血的发生即是由一酶切位点的改变的改，正常情况下靶DNA 的扩增产物为294bp，经OxaNI消化后产生191bp和103bp二个片段，但镰状细胞贫血的 突变使该切点消失，OxaNI消化后仍为294bp的片段，而杂合子则是有294、191和103 三个片段。用引方法检测突变快速可简便，但必须在突变点涉及到限制性内切酶切关 并引起进次复时不能