2010色谱法及其在生化分析中的应用3.pptVIP

亲和作用中的相互作用力 静电作用 氢键 疏水性相互作用 配位键 弱共价键 影响亲和作用的因素 离子强度 pH 抑制氢键形成的物质 温度 螯合剂 亲和作用体系 特异性 亲和体系 高特异性 酶--底物、产物、抑制剂 抗原--单克隆抗体 荷尔蒙--受体蛋白 核酸--互补碱基链段 群特异性 免疫球蛋白--A蛋白、G蛋白 酶--辅酶 酶、蛋白质--过渡金属离子（Cu2+,Zn2+) 凝集素--糖、糖蛋白、细胞表面受体 配基（ligand)：亲和作用分子对中被固定在固体粒子上的分子。 L+E?E ·L 解离常数：Kd=[E][L]/[EL] 结合常数：Ka=1/Kd=[EL]/[E][L] 亲和体系的结合常数为104-108dm3/mol 亲和层析原理 亲和层析是利用偶联亲和配基的亲和吸附介质为固定相亲和吸附目标产物，使目标产物得到分离纯化的液相层析法 亲和层析-操作过程 亲和配基 酶的抑制剂: 大豆胰蛋白酶抑制剂 抗体：抗体-抗原，Ka=107-1012。单抗免疫亲和层析 A蛋白：与免疫球蛋白IgG结合。 凝集素：与糖特异性结合的蛋白。伴刀豆球蛋白。 辅酶和磷酸腺苷：辅酶I，与脱氢酶，激酶结合。 三嗪类色素：分子内含三嗪环的合成活性染料。Reactive Blue 2 与脱氢酶，激酶结合。 过渡金属离子:Cu2+,Ni2+,Zn2+ 组氨酸: 咪唑环，静电和疏水作用。 肝素：哺乳动物的脏器内的酸性多糖物质。，与脂蛋白，脂肪酶抗凝血酶等结合。 亲和吸附介质 将亲和配基共价偶联在固体粒子表面（孔内）即可制备亲和吸附介质 具有亲水性多孔结构，无非特异性吸附； 物理和化学稳定性高，有较高的机械强度 含有可活化的反应基团 粒径均一的球形粒子 亲和配基固定化 亲和配基的固定化方法 介质的活化 溴化腈活化法：-NH2，在碱性条件下完成。 环氧基活化法： -NH2, -OH, -SH 直接固定法和间接固定法(氧化法，碳二亚胺法，戊二醛活化法) 硅胶的活化法: -OH，不宜在碱性条件下进行。 间隔臂的作用 当配基分子量较小时，为了排除空间位阻作用，需要在配基和载体之间连接一个“间隔臂” 间隔臂的长度有一定限制，超过一定长度后，配基与目标分子的亲和力会减弱 过程及影响因素 过程：进料→清洗→洗脱→柱子再生。 应保证配基对目标产物有较高的吸附容量。 目标产物在亲和介质上的吸附平衡多用Freundlich或Langmuir型的等温式表示。 进料过程中的杂质影响 料液中目标产物浓度很低，杂质很多，少量杂质的非特异性吸附，会大大降低纯化效果。杂质的非特异性吸附量与其浓度、性质、载体材料、配基固定化方法等众多因素相关。 进料的料液流速 流速的增大，分离速度加快，但柱效降低。 目标产物洗脱 特异性洗脱 洗脱剂：含有与亲和配基或目标产物具有亲和作用的小分子化合物 例：精氨酸溶液洗脱赖氨酸为配基亲和吸附的t-PA 目标产物洗脱 非特异性洗脱：调节洗脱液的pH值，离子强度，离子种类或温度等理化性质。 柱子：BSA-Sepharose 4B 洗脱方式：逐次降低洗脱液pH值 分离组分：BSA血清不同的抗体组分。 应用举例 组织纤溶酶原激活剂（t-PA）的纯化 干扰素（IFN）的纯化 重组人白细胞干扰素，经一步单抗免疫亲和层析，rhIFN-α比活提高了1150倍，收率达95%。 柱子：精氨酸-Sepharose 4B亲和柱 洗脱液：盐酸胍（GuCl) 猪心组织t-PA :活性提高7倍，收率为56% 1.气相色谱法与高效液相色谱法的定性参数是（），定量参数是（）薄层色谱法的定性参数是（）。 3. 高效液相色谱仪的组成 4.简述气相色谱法和高效液相色谱法的主要异同点 2.薄层色谱法中，比移值的最佳范围是（） 思考题 气相色谱法是指用气体作为流动相的色谱法。，根据所用固定相状态的不同可分为气-固色谱(GSC)和气-液色谱(GLC)。 GC主要是利用物质的沸点、极性及吸附性质的差异来实现混合物的分离。 1. 气相色谱分离过程 当试样由载气携带进入色谱柱与固定相接触时，被固定相溶解或吸附; 随着载气的不断通入，被溶解或吸附的组分又从固定相中挥发或脱附; 挥发或脱附下的组分随着载气向前移动时又再次被固定相溶解或吸附; 随着载气的流动，溶解、挥发，或吸附、脱附的过程反复地进行。 2. 分配系数（ partion factor） K 组分在固定相和流动相间发生的吸附、脱附，或溶解、挥发的过程叫做分配过程。在一定温度下，组分在两相间分配达到平衡时的浓度（单位：g / mL）比，称为分配系数，用K 表示，即： 分配系数是色谱