一株进口痘病毒疫苗株整合序列的研究.docVIP

一株进口痘病毒疫苗株整合序列的研究高明超1，陈静，张志2，杜元钊3，刘秀梵1 （1.扬州大学农业部畜禽传染病学重点开放实验室; 江苏扬州 225009； 2.中国动物卫生与流行病学中心，山东青岛 266032；3.青岛易邦生物有限公司，山东青岛 266032） 摘 要：本文根据禽痘病毒(FPV)基因组中禽网状内皮组织增生症病毒(REV) 常见整合区域的序列设计合成的一对引物，对国外一株疫苗进行了PCR扩增，结果扩增出一条1478bp的片段，经过测序和序列分析表明该片段为REV和FPV的整合序列，痘病毒序列中整合了大小为193bp的REV长末端重复序列，进一步比较显示该序列与国外REV毒株APC566、713和SNV的同源性分别为：99.6％、98.0％和87.3％，与我国REV分离株HA9901的同源性只有83.6％。同时该REV整合序列与国外已经测定的痘病毒毒株AJ581527、AY255633、AF198100、AF006064和AF246698比较时发现，这些毒株中含有的REV序列不仅完全一致，而且REV序列的插入位点也完全相同。这说明国外痘病毒疫苗中不仅含有REV整合序列，而且已经存在多年了。 关键词：痘病毒，网状内皮组织增生症病毒，重组株，整合 近年来关于鸡痘病毒（Fowlpox virus, FPV）基因组中整合有网状内皮组织增生症病毒（Reticuloendotheliosis Virus, REV）序列的报道不断增加，研究者们开始关注这种不同科属病毒间的基因重组[1]。美国、澳大利亚等不同地区都陆续报道了鸡痘病毒和鸽痘病毒中整合有网状内皮组织增生病病毒序列，不仅疫苗当中整合有REV 的 LTR 片断或是REV全基因组序列，而且野毒株中也几乎含有REV的前病毒全基因序列[2-3]。更有报道认为这种现象早在50年前就已经发生了[4]。已有研究证实，随着FPV 和REV的不断繁殖和演变，这种整合变得更普遍、更稳定,也说明这种整合对于痘病毒的增殖和感染都是有益的[5]。而且这种整合对FPV的生物特性产生很大影响，其中最明显的表现为FPV疫苗保护力的下降；野毒致病力的增强等[5]。 我国的研究者也发现不仅分离的野毒株中含有REV的前病毒基因序列，而且国产疫苗当中也整合有REV 的 LTR 序列 [6-7]。我国目前市场上出售的痘病毒疫苗种类多样，既有国产的疫苗，也有进口的疫苗，面对痘病毒疫苗免疫效果不理想的现状，我们一直担心这种状况是否与痘病毒疫苗中携带REV部分序列片段有关，也一直在努力寻找不带有REV基因序列的“纯”痘病毒疫苗，在此过程中我们意外地发现一株进口疫苗的基因组中也携带REV基因序列，本文此疫苗为研究材料进行了进一步的研究，以期更深入地了解REV整合入痘病毒疫苗的机制、对痘病毒疫苗的影响及其整合意义。 1 材料和方法 1.1材料 SPF鸡胚购自于山东济南斯帕法斯公司，自行孵化。鸡胚成纤维细胞按常规方法制备。MEM购自于Hyclone公司，小牛血清购自于上海塞达公司。蛋白胨和酵母抽提物购自于英国OXOID公司 ；禽痘病毒疫苗：Avian Encephalomyelitis-Fowl Pox Vaccine Live Virus 疫苗购自MERIAC公司。. 作者简介：高明超男，硕士，Email:GMC8109@126.com 通讯Email:zhizh2001@126.com ***责任作者：杜元钊，研究员，Email： 1.2 疫苗的处理与病毒的繁殖 将购买的Avian Encephalomyelitis-Fowl Pox Vaccine Live Virus 疫苗用5ml 灭菌PBS 液稀释。取0.1ml疫苗稀释液接种已长满的鸡胚成纤维细胞（CEF）单层上，置5% CO2，37℃培养箱中培养，待细胞传代至出现典型的FPV病变时收取细胞毒。同时用国内的一株痘病毒疫苗毒和一株REV 毒株HA9901接种CEF做阳性对照，未接种CEF作为阴性对照。 1.3 细胞DNA的提取 接种出现FPV病变后，加入胰酶消化，离心，用PBS洗一次，加入组织抽提缓冲液（100mmol/L Nacl, 25 mmol/L EDTA PH8.0, 10 mmol/L Tris-cl PH 8.0, 0.5% SDS）和100μg/ml蛋白酶K，52℃消化过夜后，用等体积的苯酚：氯仿抽提一次，再加入2倍体积的无水乙醇和1/10体积的乙酸钠（3M PH 5.2） 沉淀，用70%的乙醇洗涤一次，自然干燥，加80μl的TE溶解，-20℃冷冻保存。阴阳性对照的处理与此类似。 1.4 PCR扩增 根据国外发表文献，以最容易发生病毒整合的痘病毒基因组201和203蛋白序列区域设计合成了一对引物： 上游201F：5‘-CCACCGG