植保生物技术实验安排.docVIP

分组：第一组：植保1班（2号李丁-29号蓟晓玲） 第二组：植保1班（31号尹晓娟-56号郭嗣瑞） 第三组：植保2班（1号刘小慧-25号谢佼昕） 第四组：植保2班（26号吉夏洁-57号杨鹏飞） 每组一整天（上午8点，下午2点半） 共15个学时，所开实验如下： 实验一：生技实验室主要仪器介绍及注意事项 实验二：质粒DNA的制备 实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA 实验四：运用多聚酶链式反应技术进行基因扩增 实验五：琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果 实验一：生技实验室主要仪器介绍及注意事项 主要介绍进入实验室注意事项；主要仪器设备的用法及注意事项；有毒试剂的用法及注意事项等。 实验二：细菌基因组DNA的制备 　　细菌基因组DNAase A 除去。 三、仪器和试剂 （一）材料 细菌培养物。 设备 　　移液管, 高速冷冻离心机, 台式离心机，水浴锅。 试剂 　　1、CTAB/NaCl溶液：4.1g NaCl溶解于80ml H2 O,缓慢加入10g CTAB,加水至100ml。 　　2、其它试剂：氯仿:异戊醇(24:1)，酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)，异丙醇，70% 乙醇，TE，10% SDS，蛋白酶 K (20mg/ml或粉剂)，5mol/L NaCl。 四、操作步骤： 　　1. 100ml 细菌过夜培养液, 5000rpm离心10分钟, 去上清液。 　　2. 加9.5ml TE悬浮沉淀, 并加0.5ml 10% SDS, 50μl 20mg/ml(或1mg干粉)蛋白酶 K, 混匀, 37℃保温1小时。 　　3. 加1.5ml 5mol/L NaCl, 混匀。 　　4. 加1.5ml CTAB/NaCl溶液, 混匀, 65℃保温20分钟。 　　5. 用等体积酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提, 5000rpm离心10分钟, 将上清液移至干净离心管。 　　6. 用等体积氯仿:异戊醇(24:1)抽提, 取上清液移至干净管中。 　　7. 加1倍体积异丙醇, 颠倒混合, 室温下静止10分钟，沉淀DNA。 　　8. DNA沉淀, 70%乙醇漂洗后, 吸干,溶解于1mlμg/ml）中室温放置一段时间, -20℃保存。 LoadingBuffer 4．DNA分子量标准参照物（DNA marker） 5．植物基因组DNA 6. 上样缓冲液（TBE） 四、实验步骤 （一）制备琼脂糖凝胶 1．取0.16g琼脂糖置入装有20ml 0.5X TBE的三角瓶中，微波炉加热沸腾使其溶于0.5X TBE中。加0.5μl溴化乙锭贮存液，混匀。 2．液温度降至65度左右，缓缓将其注入一个带有梳子的制胶床，避免有气泡产生。让胶在室温中冷却至凝固。在次期间： 1）准备DNA样品 2）胶凝固后，将胶床置于有0.5XTBE电极缓冲液的电泳槽中。通常，缓冲液高于胶面0.5cm。轻轻移去梳子，小心，不要使胶孔破裂。 （二）上样及电泳 1．吸取约含10ul的植物基因组DNA溶液，加2μl 10X LoadingBuffer，用移液器吸取，缓缓注入凝胶上的加样孔。 2．加样毕，用电源线连接电泳槽和电泳仪（注意正负极，DNA片段从负极向正极移动），打开电源，设定电压或电流，开始电泳。 （三）染色及观察 当指示剂迁移至凝胶约1-2cm处时，关闭电源取出凝胶，染色、脱色后在紫外灯上观察并拍照。 实验四：运用多聚酶链式反应技术进行基因扩增 一、实验目的 通过本实验学习PCR反应基本原理和实验技术 二、实验原理 PCR（polymerase chain reaction, PCR）技术快速敏感、简便易行，其原理与细胞体内发生的DNA复制过程十分相似。首先是双链DNA在临近沸点的温度下变性分离成两条DNA分子单链，然后DNA聚合酶以单链DNA为模板，以反应混合物中的寡聚核苷酸为引物，利用四种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）合成新生的DNA互补链。PCR反应中所用的引物是按照与被扩增区段两端序列互补的原则设计的，这样每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开始合成，沿着相反链延伸。因此，每一条新链上的起点就是下一轮扩增反应引物的结合位点。 从理论上讲，PCR反应n个循环之后的DNA的拷贝数应当是2n-2，经过30个循环反应，靶DNA在理论上可以得到109的扩增，实际上得到的大约是106到107倍的扩增。因此，靶DNA得以在体外快速大量合成。典型的PCR反应体系由以下组分组成：DNA模板，反应缓冲液，dNTPs，MgCl2，引物TaqDNA聚合酶。 PCR反应多次重复进行的温度循环周期均是由高温变性、低温退火和适温延伸三个步骤组成。一般，在变性温度为94到95度条件下，DNA变性分离成两条DNA分子单链；退火温度在不同的反应体系有所不同，主要是根据引物的解链温度