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牛血红细胞中Cu/Zn-SOD的提取 导师：魏 建 民 学生：侯 静 学号：2013211032  牛血红细胞中Cu/Zn-SOD的提取 一、SOD简介 SOD,超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase,SOD）是一种重要的抗氧化酶，能够保护暴露于氧气中的细胞 。它能够催化超氧化物通过歧化反应转化为氧气和过氧化氢，广泛存在于生物体的各种组织中，能清除超氧阴离子自由基，而具有细胞毒性，可使脂质过氧化，损伤细胞膜，引起炎症，肿瘤和自身免疫性疾病，并可能促使机体衰老。最为常见的一种酶，呈绿色，主要存在于机体细胞浆中；第种是含铁金属辅基，呈黄褐色，存在于原核细胞中第种是是含锰金属辅基的，呈紫色，存在于真核细胞的线粒体和原核细胞内。SOD应用潜力 正常健康机体内自由基的形成和清除处于一种动态平衡中，但随着年龄的增长，体内SOD的含量呈下降趋势，相应的，增长的自由基会破坏机体的平衡，使机体产生各种疾病 ，所以保持体内适量的SOD是维护健康和延缓衰老的有效途径。有实验能间接证明，口服SOD有一定的积极作用。 从动物植物或者一般的微生物里提取出来的SOD稳定性较差，不能耐高温和酸 ，要想把各种来源的SOD做成食品，需要对SOD本身及载体进行改造。例如，口服SOD的时候同时服用酶抑制剂，应用膜透过促进剂，脂质体和微囊包埋等。本实验就是先进行SOD提取，随后通过层层自组装技术对SOD进行微囊包埋。 三、实验流程 1、溶血液的制备 （1）采血：采集新鲜牛血10L，立即加入抗凝血剂柠檬酸三钠（10Kg血加380g）,摇匀，保存备用。因为柠檬酸钠与钙离子结合形成可溶性络合物，能缓解钙离子促使血液凝固。 （2）收集红细胞，是将牛血离心15min，用生理盐水悬浮洗涤2～3次，将所得红细胞分装到离心管中，放入-80℃冰箱中，冷冻保存。用生理盐水洗涤红细胞能除去全血中80%的白细胞和99%以上的血浆，洗涤过程中可以同时去除钾、氨、乳酸、抗凝剂等。 （3）溶血：将冷冻保存的红细胞放在室温下自然解冻，然后加入等体积蒸馏水，于磁力搅拌器上冰浴搅拌15min，使血红细胞细胞壁破裂，迫使Cu/Zn-SOD浸出，即得到溶血液。 2 、粗酶液的制备 （1）乙醇，氯仿对Cu/Zn-SOD影响很小，故而可采取乙醇，氯仿去除血红蛋白。向正在冰浴中搅拌得溶血液里缓缓加入0.4倍体积的，-20℃预冷的乙醇-氯仿（3:5，V/V），继续搅拌30min，此时，溶血液变为砖红色，呈粘稠状。 （2）将溶血液装入10mL离心管中，于4℃，3000rpm/min，离心15min，收集上清液，弃沉淀，过滤后，冰浴备用。 3 、热变性除杂蛋白及最佳热变条件研究 Cu2+、Zn2+两种离子对SOD具有保护作用,其中Cu2+可以保护SOD的活性中心，而Zn2+ 则对于SOD的复性具有促进作用，并且对其他的蛋白质也有变性作用。另外，SOD的耐热程度比较高，因此可以采用热变性的方法除去杂蛋白。按照正交试验得出的最优组合结果，加入最优浓度的Cu2+、Zn2+，将水浴锅温度调成最佳温度，以最优热变时间进行热变性，此时，随着时间的增加，大量的杂蛋白都已经变性凝集，呈白色或者浅黄色絮状沉淀。SOD异常高的热稳定性，主要是其中金属辅基的存在。 4 、 丙酮沉淀 向上述冰浴中保存的装有清液的离心管中缓缓加入等体积的，-20℃预冷的丙酮，丙酮能够夺取水分使蛋白质沉淀下来，待充分摇匀后会出现大量淡蓝色絮状沉淀（SOD特有的颜色），于4℃，3000rpm/min,离心15min，弃上清，留沉淀，沉淀即为Cu/Zn-SOD，此时，向各离心管中加入已经配好的0.05M PBS各10mL,即得SOD酶液，冰浴保存备用。PBS缓冲液（磷酸盐缓冲液），起溶解和保护试剂的作用。 5、 透析处理及冷冻干燥 SOD分子量大约在31～33KD，因此选用规格为MD34（8000-14000）的透析袋，其中MD后边的数字代表透析袋压平后的宽度（单位：mm），括号里的数字代表截流分子量。蛋白质的分子量一般用道尔顿（Da）表示。 （1）透析袋预处理：将透析袋剪成适当长度的小段，在含有2%（m/v）碳酸氢钠和1mmol/L的EDTA的溶液中煮沸10min，取出后用蒸馏水洗净，再在1mmol/L EDTA溶液中继续煮沸10min，用蒸馏水冲洗后备用。进行透析袋预处理主要是为了避免透析的分子损失活性。EDTA能够螯合透析袋上残留的金属离子。透析袋出厂时含有极微量的硫化物、重金属和一些具有紫外吸收的杂质，对蛋白质和其它生物活性物质有害，用前必须除去。 （2）透析：将上述制得的SOD酶液全部装于透析袋内，用线将透析袋两边扎紧，直到不再有液体渗出为止，然后放入盛有蒸馏水的大烧杯中，至于4℃冰箱中，并用磁力搅拌器不停搅拌，透析