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电子克隆及序列分析 王兴平 什么是电子克隆 拼图游戏一样的原理 应用 操作过程 优点与缺点的讨论 现状与展望 什么是电子克隆 Watson Crick 成功解析了DNA分子二级结构，开创了分子生物学时代 Karry Mullis 发明了PCR反应，体外大规模、有目的和快速地克隆目标基因成为可能 信息科学技术特别是数据库技术在战后飞速发展 什么是电子克隆 表达序列标签（expressed sequence tags，EST）是对某个基因cDNA克隆测序所得的部分序列片段，长度大约为200~600bp 由于基因表达调控作用不同，同一个基因的mRNA剪接位点和方式不同，所以同一个基因的全长cDNA可能包含多个EST EST既代表了基因cDNA的某一区段，也表征了成熟mRNA可能的剪接方式 什么是电子克隆 电子克隆技术是生物学数据库中EST数据库、核酸序列数据库、基因组数据库，采用同源性序列比对和归类分析、重叠区域组装和拼接等方法延长EST序列，直至没有与之同源的序列可供拼接为止，所得到的序列可以认为是相对应基因的全长cDNA，根据所得的cDNA序列设计囊括开放阅读框两端的引物，进行RT-PCR克隆出相应基因的方法 什么是电子克隆 传统的克隆方法是利用基因特异性引物大量扩增cDNA末端或构建cDNA文库并采用原位杂交进行筛选，实验进程长、步骤繁琐、成本高、得率低；运用电子克隆的方法延伸得到的cDNA几乎囊括了所有疑似为目的基因的cDNA序列，无论表达转录如何调控，都能通过PCR扩增出表达的那一段基因 传统的方法如同小规模地捕捞一条或几条鱼，电子克隆与之相比就如同集约化地捕捞一群鱼 拼图游戏一样的原理 相近的物种在核酸序列上有相似性，相近物种中的同源基因序列在一定程度上可以代表目的基因的序列 可代表程度与两序列的相似度直接相关，加之遗传密码的简并性，这种混同在理论上是可行的 ，但需要作同源性检验以克服主观因素的影响 拼图游戏一样的原理 借助计算机找到具有相同或相似图案的图块，拼成完整的图案，我们需要做的是进行局部的微调。 剩下的工作就是对拼接出的cDNA进行可能的开放阅读框的分析，设计囊括开放阅读框两端的引物，RT-PCR扩增侯选基因 应用 电子克隆主要应用于两个方面： 一个是利用EST序列检索同源性序列，并由此拼接cDNA序列以期挖掘新基因 另一方面是在全基因组已经测序的物种中，研究整个基因组序列以推测其中可能尚未发现的基因 目前应用比较广泛的是第一方面 应用 数据库查询 数据库比对 文件下载 序列分析 序列装配 分子模型 结构分析 功能分析 应用 在全基因组已经测序的物种中推测新基因的步骤如下： 分析和定位开放阅读框 虚拟翻译并对多肽链序列检索比对 可靠性检查 分析与之相关的调控序列 如何做拼图游戏 基于EST的电子克隆 基于Unigene的电子克隆 常用软件及网络资源简介 DNAStar是一款电子克隆中常用的软件包，它以功能全面和强大而著称，它主要包括以下几个应用程序：EditSeq、GeneMan、GeneQuest、MapDraw、MegAlign、PrimerSelect、Protean、和SeqMan II 常用软件及网络资源简介 EditSeq是输入并且修剪DNA或蛋白质序列的工具。EditSeq能读取大部分的序列格式，也可以通过使用键盘输入，或者从其他地方复制、粘贴得到。序列被打开后，EditSeq能使用标准或者指定的遗传密码进行翻译或反翻译、寻找开放读框以及进行阅读校对 优点与缺点的讨论 与传统的基因克隆方法相比，电子克隆有以下的优点： 简便快速，成本低廉，设备简单 对操作人员技术要求不高 成功率高 优点与缺点的讨论 尽管电子克隆在理论上已没有什么障碍，然而在实际操作中依然存在些不足之处： 电子克隆得到的cDNA序列是由计算机虚拟出来的，现实中可能并不存在 研究人员不可完全迷信软件提供的结果，最好对分析做人工可靠性验证 普遍适用性较差 电子克隆后需要研究其指导合成的蛋白质的功能才更有实际意义 现状与展望 国外的科研人员做了许多有益的贡献，特别是水稻、拟南芥等全基因组测序完成后，借助软件分析，从中发现和克隆了一系列全新的基因 我国的研究人员也进行不少的具有建设性和创造性的探索和尝试，也取得了令人鼓舞的成果 现状与展望 随着科学技术的不断发展，以及数据库准确性的逐渐提高，电子克隆的两大制约因素，辅助设计软件和数据库将日臻完善，电子克隆技术将日趋成熟。 电子克隆技术有可能从根本上改变人们对与基因克隆的看法，改变基因克隆长久以来沿用的策略，改变科研人员关注焦点，促使研究人员致力与生物大分子的功能，以更好的造福于全人类 * * 核酸序列分析实例： 内 容 （一）基于EST的