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实验设计报告 　 项目名称： AFB1单独作用及其与AFB2共同作用对大鼠肝细胞DNA损伤比较 　　　 申 请 者： 一、立论依据 　　　　 1.研究背景 食品安全是人们都极其关注的,尤其是绿色食品和有机食品概念的提出更加增加人们对食品安全的关注。食品安全的影响因素很多,其中AF的危害是比较突出的一个问题[1]。 黄曲霉毒素(Aflatoxin简称AF)是由真菌黄曲霉和寄生曲霉产生的一组强毒性的二氢呋喃香豆素的衍生物，主要有B1,B2,G1,G2 以及另外两种代谢产物M1,M2，在我国,食物、药品原料、农副产品及其制成品均易被AFT污染,其中以黄曲霉素B1(AFB1)污染最广泛,毒理作用也最强,是目前所知的最强的致癌物质,对它的研究是目前国内外关注的热点，AF污染已导致严重的食品安全问题[2]。 黄曲霉毒素的危害性在于对人及动物肝细胞DNA产生损伤，严重时可导致肝癌甚至死亡。但目前缺乏对AFB1单独作用及其与AFB2共同作用对小鼠肝细胞DNA损伤情况比较的研究。 2.立题依据、 研究目的和意义 通过探索 AFB1单独作用及其与AFB2共同作用对大鼠肝细胞DNA损伤的比较，揭示AFB1与AFB2对肝细胞DNA损伤是否存在相互作用。 3.创新之处 目前对AFB1的研究较多，但缺乏对AFB1单独作用及其与AFB2共同作用对大鼠肝细胞DNA损伤情况比较的研究。 4.主要参考文献目录和出处 【1】史贤明.食品安全与卫生[M].北京:中国农业出版社, 2003 【2】潘葳,庞广昌.黄曲霉毒素与食品安全[J].江西食品工业, 2004(3): 30-31. 【3】谢剑锋等.黄曲霉素B1诱导铁过载鼠肝细胞DNA损伤的研究，2010（4）:1-3. 1.研究方法和技术路线 材料与方法 1.1　材料　3月龄Wistar雄性大鼠,体重300~400 g。AFB1单克隆抗体和8-羟基-2-脱氧鸟苷(8-OHdG)单克隆抗体。其中AFB1单抗工作浓度为0.15μg/ml,8-OHdG单抗工作浓度为0.312 5μg/ml。二抗为HRP标记的羊抗鼠IgG,工作浓度1∶100。正常羊血清购 自丹麦Dako公司,工作浓度1∶10。正常羊IgG抗体工作浓度1∶20。阴性对照使用的正常鼠IgG抗体工作浓度0.312 5μg/ml。二氨基联苯胺(DAB). 1.2　动物分组和处理 　 30只体重约400 g的Wistar雄性大鼠,随机分成A、B组。,每组各15只。A组和B组分别以3只/组,再分成5组,A组注射AFB1，B组注射AFB1与AFB2的混合物，两组分别按照1 ng/kg、100 ng/kg、10Lg/kg和1mg/kg的剂量腹腔注射AFB1或AFB1与AFB2的混合物,0剂量组直接注射溶剂DMSO(二甲基亚砜)　　注射24 h后,分别解剖相应试验获取肝脏组织。组织经福尔马林固定,梯度酮和二甲苯脱水,石蜡包埋后,进行5μm厚切片。 1.3　切片组织形态评估　 采用苏木精-伊红（HE）染色法来评价切片组织形态。组织切片先经60℃加温30 min后,经丙酮和梯度酒精脱蜡理,然后分别用苏木精和伊红染色,再经梯度水和二甲苯处理后,用中性树胶封片后显微镜下察组织形态。 1.4　免疫组化试验及阳性判定 　 选择同批形态好的切片进行免疫组化试验。组织切片处理,用PBS和DDW漂洗后将切片浸入0.01M柠檬酸(pH=6.00),置微波炉95℃10 min,待却至室温,用DDW漂洗3 min,然后浸泡在H2O2的DDW中室温5 min(AFB1:含0.3的甲醇室温作用15 min),PBS漂洗后将切片盒中,加入正常羊IgG抗体室温作用1 h,然后加入一抗,室温过夜(AFB1仅作用2 h即可)。 P后,用0.075% Brij/PBS充分洗涤3次,min,再将切片浸泡于PBS中保持切片湿润切片加上二抗后放入湿盒室温作用1 h。用Brij/PBS充分洗涤3次,每次15 min后,避于DAB/Ni/Co/ H2O2(DDW 90 ml、DAB1M-PB 10 ml、NiSO42 ml、Cobalt 2.5 ml、μl)的显色溶液中,室温作用5 min(AFB1用Tris-HCl /H2O2室温作用10 min),立即流次,DDW冲洗5 min。最后经过脱水后封片织,显微镜下观察染色情况。细胞阳性判定清晰,染色明显高于背景为标准。8-OHdG深蓝色,AFB1染色为褐色。 2. 所需的主要仪器设备及试剂： 试剂： 3月龄Wistar雄性大鼠 、 AFB1单克隆抗体 、 8-OHdG单克隆抗体 、 HRP标记的羊抗鼠IgG 、 正常羊血清、正常羊IgG抗体 、 正常鼠IgG抗体 、 二氨基联苯胺(DAB)、DM