硅胶膜型trade;PCR产物纯化及胶回收试剂盒.doc

硅胶膜型?PCR产物纯化及胶回收试剂盒 操作方法/体积比1:3（琼脂糖重量：NE结合液E结合液。如200mg琼脂糖加600ml NE结合液。50~60℃水浴3~5分钟，胶完全融化即可，其间可上下颠倒2~3次。 将溶液转入离心纯化13,000rpm离心10~20秒，倒掉收集管中的废液。 适当增加DNA与硅胶膜结合的时间，使DNA与硅胶膜充分结合，能在一定程度上提高回收率。 加入500μl的80%异丙醇或80%乙醇纯化13,000rpm离心10~20秒，倒掉收集管中的废液。 重复步骤4。 13,000rpm再次离心1分钟，尽量除去残余异丙醇或乙醇纯化 加入40~50μl无菌TE溶液或超纯水，静置3~5分钟，使洗脱液充分将硅胶膜浸透。 TE溶液或超纯水的用量视用户对DNA浓度的要求而定。将TE或超纯水50℃预热对提高回收率有一定帮助。 3,000rpm离心1分钟，管底溶液即为所需的DNA。将DNA贮存于-20℃可长期保存。 离心柱放入离心管中，若盖不上盖子，亦没有关系，可开盖离心。 二、从溶液中回收DNA片段 往无石蜡油的PCR反应液50~100μl）中加入3倍体积的NE结合液颠倒混匀。分钟3,000rpm离心1020秒，倒掉收集管中的废液。 l的80%异丙醇或80%乙醇纯化13,000rpm离心10~20秒，倒掉收集管中的废液。 重复步骤2。 13,000rpm再次离心1分钟，尽量除去残余异丙醇或乙醇纯化2~3分钟，使乙醇挥发殆尽。 一定使乙醇挥发干净，否则影响其回收率及纯度。 加入40~50μl无菌TE溶液或超纯水，静置3~5分钟，使洗脱液充分将硅胶膜浸透。 TE溶液或超纯水的用量视用户对DNA浓度的要求而定。将TE或超纯水50℃预热对提高回收率有一定帮助。 可能原因 参考意见 回收率低 洗脱液pH7.0 用TE或pH7.0的无菌超纯水洗脱 洗脱温度过低 加入50℃温育的无菌超纯水或TE浸透硅胶膜 回收片段过大或过小 最适宜的回收片段为150bp~5Kb 对于小于150bp的小片段，增大NE结合液 盐的浓度过高 用80%乙醇漂洗回收产物 增加漂洗次数 残留有有机试剂 增加离心时间，将80%乙醇或异丙醇去除干净 部分双链DNA变性为单链DNA 在进行后续酶反应时，加入除酶以外的其它成份，95℃加热2分钟，缓慢冷却至室温（25℃以下），使单链DNA重新退火为双链DNA，然后加入酶，继续进行酶反应 用含有10mM NaCl的Tris Buffer洗脱DNA片段。（注意：盐的浓度可能影响后续实验） 将约2μg的PCR产物在1%的琼脂糖凝胶中电泳后，切下DNA条带，然后使用本试剂盒纯化。取十分之一的量进行电泳检测，结果表明回收率达80%以上。 胶回收DNA片段电泳图 1%琼脂糖凝胶电泳（GoldView染色） 1. 胶回收的100bp片段 2. 胶回收的200bp片段 3. 胶回收的300bp片段 4. 胶回收的400bp片段 5. 胶回收的600bp片段 6. 胶回收的800bp片段 7. 胶回收的1,200bp片段 8. 胶回收的1,700bp片段 9. 胶回收的2,000bp片段 10. 胶回收的2,400bp片段 11. 胶回收的2,700bp片段 12. 胶回收的3,000bp片段