实验一工业微生物的筛选和紫外诱变育种.docVIP

实验一 工业微生物的筛选和紫外诱变育种 一．实验目的：加深对发酵工程上游技术中菌种选育的认识；学会常规选种和育种的方法，树立科学认真仔细的态度，培养科研协作精神。 二、实验原理：根据一定的生产目的如抗生素或酶类的生产，建立不同的筛选模型，并从特定的样品如土壤中筛选出高产适宜的菌株。 三．培养基及仪器： 降解亚硝酸盐培养基：NaNO2 0.2%，KH2PO4 0.7%，MnSO4.H2O 0.25%，Na2HPO4 1.35%MgSO4.7H2O 0.1%，葡萄糖1％，琼脂2％，0.1MPa灭菌20分钟。6个250ml100ml培养基。 同时灭菌试管20支，1ml吸管12支，普通平皿60个，灭菌生理盐水。培养亚硝酸盐降解菌发酵液1瓶，每位同学准备1个斜面。 3．洁净工作台、培养箱、三角瓶、曲玻棒、平皿。 四．操作方法 课前半小时打开超净工作台灭菌。 1.土壤中降解亚硝酸盐细菌的筛选分离 稀释土样。5g土样，加入45ml无菌水中。为10-1，然后取1ml加入9ml无菌水，为稀释10-2，直至稀释至10-8溶化培养基。 将溶化后不烫手的培养基倒入平皿，刚好盖过平皿底部，迅速摇匀后放置，使培养基冷却，要求平皿培养基表面平整、光滑。吸取10-4，10-5或10-6相应浓度的土样稀释液0.5ml，加入平皿内，用烧过灭菌的曲玻棒均匀涂平，放入37℃培养箱中倒置培养48小时。 2.亚硝酸盐分解菌的紫外诱变育种 取10ml培养好的液体培养液，90 mm培养皿，将皿放置于诱变箱的磁力搅拌器上,置于30 W 紫外灯下，照射90 s，10-6，10-7，10-8，按常规方法涂布筛选平板。 实验二 雅致放射毛霉发酵生产蛋白酶的培养基确定 一、实验目的：掌握微生物斜培养基确定方法，学会对已确定菌种确定实验室发酵工艺。 二、实验原理：筛选微生物最适生长及产物形成的营养条件和培养条件，以确定特定产物发酵的工艺参数。 三、仪器及试剂 ：蔗糖，酵母膏，MgSO4等 高压灭菌锅、洁净工作台、恒温振荡培养箱。 四、操作方法： 1、种子培养基 2、产酶培养基确定2.1培养基的配制，各组分别选择以下六种培养基配方： （1）基础培养基：（100ml）豆粕粉3g，蔗糖0.8g，酵母膏0.1g，MgSO4 0.36g，KH2PO4 0.12g，CaCl2 0.1g。（第一组） （2）第二组，将基础培养基中蔗糖按成等例葡萄糖； （3）第三组，将基础培养基中蔗糖按成等例马铃薯淀粉； （4）第四组，将基础培养基中去掉酵母膏； （5）第五组，将基础培养基中去掉豆粕粉，并将酵母膏添加量增至0.5％。 （6）第六组，将基础培养基中去掉MgSO4 和CaCl2。 2.2培养基灭菌 高压灭菌锅，121℃，20min灭菌。冷却至室温，将上述物品并洗耳球转入超净台，接种前20min进行紫外空气灭菌。 2.3接种 10％，然后在在28℃、250r/m的条件下培养至发酵液颜色变深、澄清为止。 2.4酶活力测定 （1）定义：1 g固体酶粉，在一定温度和pH值条件下，1 min水解酪素产生1 ug酪氨酸为一个酶活单位，以u/g表示。 （2）原理：蛋白酶在一定温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加入三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。根据吸光度计算其酶活力。 （3）试剂和溶液 ① 三氯乙酸（CCl3.COOH）=0.4 mol/L：称取三氯乙酸32.7 g，用水溶解并定容至500 mL ② 磷酸缓冲溶液 ③ 100 ug/mL L—酪氨酸标准溶液 ④ 10 g/L酪素溶液 ⑤ 待测酶液：取1ml发酵液稀释备用。 （4）分析步骤 ① 求K值 ② 测定 a. 先将酪素溶液放入（40±0.2）摄氏度恒温水域中，预热5 min； b. 按下列程序操作： 试管A（空白） （第二试管） 试管B（酶试样，作三个平行样）（第三试管） ↓ ↓ 加酶液2.00 mL （移液管2ml） 加酶液2.00 mL ↓（40±0.2℃），2 min ↓（40±0.2℃），2 min 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）（移液管5ml） 加酪素2.00 mL（摇匀） ↓（40±0.2℃），10 min ↓（40±0.2℃），10 min 加酪素2.00 mL（摇匀）（移液管2ml） 加三氯乙酸4.00 mL（摇匀）