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融合蛋白方法制备顺序酶电极 周亚凤1 张先恩H 刘 虹 EGGass 张治平An山0ny 1中国科学院武汉病毒研究所。武汉4姗l of 2AZ，L棚d佃) 2BiochemistryDep劬r唧t，IIr蚶试coUegescience，‰h∞lo口＆M出iIle，s珥7 【摘要】顺序酶电极是生物传感器的一大类群，其原理是利用数种相关酶，顺序、协 调地催化一系列反应，完成单酶传感器难以进行的检测项目。据检索从1990年至 2000年的世界生物传感学术大会的论文摘要，在目前已经报道的100多种生物传感 器中，30％以上采用顺序酶传感器法。然而．与单酶传感器相比。顺序酶传感器普遍 存在稳定性、互换性和灵敏度较差等问题。本研究以麦芽糖传感器为例，采用基因操 纵，实现糖化酶(cA)和葡萄糖氧化酶(COD)的融合，制备融合蛋白顺序酶麦芽糖传 感器，建立了融合蛋白制备顺序酶传感器的模式方法。 通过基因水平的分子操纵，将黑曲霉GoD基因、连接肤(ser—Gly)，编码序列和 因重组进大肠杆茵一酵母穿梭质粒pPIc9，实现其在甲基酶母巴斯德毕赤酵母(pfcJl缸 p∞研b)中的高效表达。融合蛋白GLG分子量高迭410kD，经岱州lar08e_“胁nw 隔离子交换柱一步纯化就达电泳纯。动力学性质分析表明，GLc基本保持了CA和 GoD的原有活力，且与酵母产生的GA和GOD具有相似的催化动力学特性。将GIG 的顺序催化效率远远高于GⅣGoD，体现了融合蛋白在固定化方面的优势。分别用 Glc和GA，GOD制备麦芽糖侍感器，并将两种传感器的性能进行了比较分析。结果 表明，GIB可有效提高麦芽糖传感器的信号强度、线性范围及酶膜的互换性，使麦芽 糖传感器的性能得到明显改善。 本研究将融合蛋白技术引入生物传感器的研究。成功地构建了具有双酶活力的 融合蛋白，以实现顺序作用酶控制的共固定化，建立了融合蛋白技术制备顺序酶传感 器的模式方法，为解决顺序酶传感器灵敏度和互换性差的难题提供了新的途径，同时 也为解决其他顺序酶反应的低效率问题提供了一种新思路。 【关键词】融合蛋白；顺序酶电极；糖化酶；葡萄糖氧化酶；麦芽糖传感器 原理是利用数种相关酶，顺序地、协调地完成一系列催化反应，与相应的换能器(咖18ductor)结 合，完成单酶传感器难以进行的检测项目。在目前已报道的100多种生物传感器中，30％以上 采用顺序酶传感器法。但是，与单酶传感器相比，顺序酶传感器的灵敏度、稳定性及互换性普 一137— 遍较差，实用化进程缓慢。在此作如下分析，设一个双酶传感器含有E1和＆两种酶，待测底 物理信号)： s寺D寺… 在这个过程中可能存在的问题包括：(1)在酶的共固定过程中，E1和E2与交联分子的亲 膜中的分布和空间距离难以控制，呈随机性，影响上游酶和下游酶的反应传递，总反应速率具 有不确定性。 长期以来，许多研究者试图通过各种改良的化学固定法和控制的酶动力学方法来解决上 述难题，但收效不明显。近年来蛋白质晶相学的研究取得了丰富的结构生物学数据，使我们有 可能在分子或超分子结构层次寻求答案，并开始通过基因水平的分子操纵来解决所存在的问 题。本研究以麦芽糖传感器为例，针对顺序酶传感器存在的问题，提出融合蛋白解央方案。通 GoD和GA之间的空间距离，使各自的构象和生物学活性互不受影响。利用融合蛋白GLc制 定，空间距离一定)，从而有效提高酶膜的活力及均一性，改善麦芽糖顺序酶传感器的响应特 性。 1．GOD—liIlk日一GA融合蛋白酵母表达载体的构建 体)和GA基因依次拼接，构建GLc融合蛋白编码基因，并将其克隆到大肠杆菌一酵母穿梭质 粒pP_C9，获得融合蛋白的酵母表达载体pPICGLG(图1)。 图l融合蛋白GIB酵母表达载体 2．融合蛋白在甲基酵母中的高效表达和纯化