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190 皮肤性病诊疗与预防·实验诊断研究· 淋球菌孔蛋白基因克隆与真核细胞表达载体的构建 扬州大学医学院微生物学和免疫学教研室 季明春 钱 莉 目前在许多发展中国家，淋球菌仍然是一个重 提取含有正向插入porin全长基因的质粒 Biotech公司的 要的性传播病原体，加强包括疫苗研制等预防措施 pCMVporin，采用Pharmareia ALFTMDNA 的研究显得非常迫切。由于淋球菌自然感染诱导非 Sequencer系统，以引物1和引物2 保护性免疫，早期全细菌疫苗实验的免疫效果不理 进行双向测序。测序结果送GenBank检索，并分析 想，促使人们用纯化淋球菌抗原作疫苗作进一步研 验证其阅读框架。 究。淋球菌porin蛋白具有较强的免疫原性和相对 1．6转染细胞和免疫组化染色检测 缓慢的抗原变异性，是目前淋球菌疫苗研究的热点。 采用聚乙烯亚胺(PEI)为转染介质，对培养 我们克隆了淋球菌孔蛋白(porin)全长基因，并成功 构建真核细胞表达载体，为进一步淋球菌基因疫苗 胞被转染后48小时，固定、洗涤后，加Porin蛋白单 研究奠定了基础。 克隆抗体、碱性磷酸酶标记二抗，NBT／BCIP显色。 1．材料与方法 镜下观察显色情况，及时终止反应并照相。阴性对照 1．1质粒与细胞株 为转染pCMVscript空载体的Hela细胞。 2．结果 真核细胞表达质粒pCMVseript购自 2．1PCR扩增淋球菌porin基因 Stratagene公司。大肠埃希菌DH5a和Hela细胞株 为本室保存。Hela细胞培养于含10％小牛血清的 以引物1和引物2特异性扩增淋球菌WHO—A RPMll640培养液中。 参考细胞株porin的全长基因，PCR产物经1％琼 1．2酶类和试剂 脂糖凝胶电泳显示为单一条带片段，大小约 1lOObp，与理论设计扩增片段大小相一致。 pCMVscript克隆试剂盒购自Stratagene公 2．2pCMVporin表达质粒的酶切鉴定及序列 司。EcoRI、Kpnl等内切酶和T4连接酶购自Roche 公司。porin单克隆抗体由南非德班大学微生物系分析 提取重组质粒，用Not Pillay教授提供。免疫组化试剂盒购自公司。聚乙烯 I和Kpnl进行双酶切鉴 亚胺(PEI，25Kd)购自Sigma公司。NBT／BCIP购 自Promega公司。 1．3PCR扩增目的基因 参照已发表的淋球菌porin基因序列，设计一 对引物，用于扩增孔蛋白基因序列。引物1：5’一GGC组质粒pCMVporin4序列分析结果表明，插入序列 GGCCGCCGCCATGAAAAAATCCCTGAT与已发表的淋球菌porin基因序列基本一致，且阅 TGC GAGTTA CC一3’，引物2：5’一GGGCTC 读框架不变，全长为1047bp，证明我们所构建的 GAATTTGTGGCGCAG pCMVporin质粒是正确的。 A一3’，引物由上海生工 生物工程公司合成。按文