SDS碱裂解法制备质粒DNA提取和纯化_百替生物.pdfVIP

SDS 碱裂解法制备质粒DNA 提取和纯化 [适用对象] 生物工程专业 [实验学时] 8 学时 一、实验目的 使学生掌握从大肠杆菌中制备质粒 DNA 的方法，提供实验所需载体。 二、实验原理 质粒细菌染色体外的 DNA 分子，其范围大小在 1kb 至 200kb 以上不等。 它独立于细菌染色体外进行复制和遗传的辅助性遗传单位。质粒在基因工程 中是最常用的载体。提取质粒 DNA 也是基因工程中最常见的实验操作。提取 质粒首先进行大肠杆菌细胞的制备，制备后用碱裂解液进行细胞裂解，使细 胞壁破裂，染色体 DNA 和蛋白质变性，将质粒 DNA 释放到上清中。尽管碱性 溶剂使碱基配对完全破坏，闭环的质粒 DNA 双链仍不会彼此分离，这因为它 们在拓扑学上是相互缠绕的。 而裂解过程中，细菌蛋白、破裂的细胞壁和变 性的染色体 DNA 会相互缠绕成大型复合物，后者被十二烷基硫酸盐包盖。当 用钾离子取代钠离子时，这些复合物会从溶液中有效地沉淀下来。离心除去 变性剂后，就可以从上清中回收复性的质粒 DNA，最后用聚乙二醇沉淀法进 行质粒的纯化。对于小量制备的质粒 DNA，经过苯酚、氯仿抽提，RNA 酶消化 和乙醇沉淀等简单步骤去除残余蛋白质和 RNA，所得纯化的质粒 DNA 已可满 足细菌转化、DNA 片段的分离和酶切、常规亚克隆及探针标记等要求，故在 分子生物学实验室中常用。 三、仪器设备 培养皿 摇床 天平 高速离心机（×12000g） 微量移液器（2－20 μl、 20－200 μl、200－1000μl）、电泳仪、微波炉。 service@100 四、相关知识点 本课程知识点综合：涉及到质粒 DNA 提取过程、质粒纯化过程和琼脂糖 凝胶电泳技术。 多课程知识点的综合：微生物学细菌的培养和质粒抽提技术。 五、实验步骤 细胞培养 接种培养 挑取 LB 固体培养基上生长的单菌落，接种于 2.0ml LB （含相应抗生素） 液体培养基中，37℃、250g 振荡培养过夜（约 12-14hr）。 离心 取 1.5ml 培养物入微量离心管中，室温离心 8000g×1min，弃上清， 将离心管倒置，使液体尽可能流尽。 细胞的裂解 悬浮细菌沉淀 将细菌沉淀重悬于 100μl 预冷的碱裂解溶液 Ⅰ中，剧烈振荡，使菌体分 散混匀。（为确保细菌沉淀在碱裂解溶液 Ⅰ中完全分散，将两个微量离心管的 管底互相接触同时涡旋振荡，可以提高细菌沉淀重悬的速度和效率。） 裂解细菌悬液 加 200μl 新鲜配制的溶液Ⅱ，颠倒数次混匀（不要剧烈振荡），并将离 心管放置于冰上 2-3min，使细胞膜裂解（溶液Ⅱ为裂解液，故离心管中菌液 逐渐变清）。 沉淀染色体和蛋白质 加入 150μl 预冷的溶液Ⅲ，将管温和颠倒数次混匀，见白色絮状沉淀， 可在冰上放置 3-5min。溶液Ⅲ为中和溶液，此时质粒 DNA 复性，染色体和蛋 service@100 白质不可逆变性，形成不可溶复合物，同时K+使 SDS-蛋白复合物沉淀。 沉淀多余的蛋白质 加入 450μl 的苯酚/氯仿/异戊醇，振荡混匀，4℃离心 12000g × 10min。 小心移出上清于一新微量离心管中。 质粒 DNA 的回收 沉淀核酸 加入 2.5 倍体积预冷的无水乙醇，混匀，室温放置 2-5min，4℃离心 12000g×15min。 洗涤沉淀 1ml 预冷的 70%乙醇洗涤沉淀 1-2 次，4℃离心 8000g×7min，弃上清， 将沉淀在室温下晾干。 溶解质粒 DNA 沉淀溶于 20μl TE （含RNase A 20μg/ml），37℃水浴 30min 以降解RNA 分子，-20℃保存备用。 质粒 DNA 电泳检测 制胶 用封边封住塑料托盘开放的两边，形成一个模具，置于一个水平支架上。 加上梳子。称取琼脂糖 0.5g，加 0.5×TBE 的电泳缓冲液 100ml，用微波炉加 热至琼脂糖熔化，待熔化的凝胶稍冷后加入溴化乙锭，使终浓度为 0.5 μg/ml。混匀凝胶。将凝胶浇灌到模具中。室温下 30－40min。 上样电泳 向电泳槽加