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获得高质量土壤 RNA 的 10 个建议 前面的文章我们介绍了如何提取土壤 DNA 。大篇幅详细讲解了影响 DNA 得率和纯度 的研磨均质、化学试剂 （重点是裂解缓冲液）等问题。做 DNA 远没有做 RNA 压力大。不 用太担心降解，得率还挺高。 RNA 就不一样。。。 提取土壤 RNA 是环境分子生物学研究最难的研究方法之一。RNA 提取本身就是件艰 巨的任务，提取土壤的 RNA 挑战更大。最大的困难之一是土壤 RNA 得率。从土壤中获得 RNA 远比 DNA 少，前者仅有后者的 10-20%，所以需要比提 DNA 更多的加样量。因此需要 用更大的研磨管（15ml）和更大的离心机。 另一个大问题是腐植酸等抑制因子的污染。RNA 实验对纯度要求很高，当逆转录寻 找低拷贝数基因时，你无法稀释 RNA 样品。要求加入反应体系中的 RNA 浓度足够高且不 能含有抑制因子。 提取土壤 RNA 需要特殊条件 因此，MO BIO 开发出了一套不使用二氧化硅离心柱的方法来提取土壤 RNA。下面讨 论关于 RNA PowerSoil Kit 以及何如获得更好的提取效果。 这套操作流程包含了多种方法。IRT 技术去除抑制因子，酚氯仿法最充分地裂解微 生物细胞，阴离子交换技术更高的纯化质量。最终获得非常干净的 RNA 最大化地满足 RT-PCR 的需要。 让我们一起来讨论如何使用这些技术，并尽可能少出错返工。每个土壤样品质地、 水分含量、微生物丰度都不一样，在提取过程中出现的状况不尽相同。下面我们重点讨 论几个容易出错的关键步骤，以及做哪些修改可以获得更好的提取效果。 1. 样品起始量 对于绝大多数类型土壤，2g 土壤是最大的样品起始量。然而，对于底泥这类含水量 较高的土壤，本身实际土壤含量较低，微生物含量也不高，我最多用到 5g 的起始量。如 果样品加入到研磨珠套管后，发现上面有一层水。最好先离心并吸去多余的水分。 2. 酚氯仿异戊醇 Phenol: Chloroform （步骤5）: 使用正确的 PCI 非常重要，在试剂盒操作说明书中我们给出了一些使用建议。PCI 比例必须为 25：24:1，pH 介于 6.7-8，并保存在 pH8.0 的 TE 缓冲液中。许多人提取动物 组织和细胞习惯性地只使用地 pH 值的苯酚来提取 RNA。而对于土壤，pH 中性的苯酚会合 适。 3. 优化异丙醇浓缩（步骤 12）: PCI 裂解步骤后加入 SR3 溶液，下一步加入异丙醇沉淀总核酸。如果你在做底泥， 加完 SR3 溶液后总体积可能超过 5ml。增加 SR4 （异丙醇）的使用量，至与步骤11 获得 的样品体积相同，以保证充分沉淀核酸。 4. 异丙醇沉淀的环境温度（步骤 12）： 标准操作说明建议-20℃冷冻样品。盐浓度高的样品核酸沉淀步骤请在室温下进行。 冷冻样品沉淀的盐分，会改变阴离子交换离心柱上的核酸吸附绑定条件。你可以从沉淀 物中看出来是否有盐分沉淀。正常的 RNA 沉淀表面平坦有光泽，若沉淀明显较大且表面 有壳，表明有盐分沉积。底泥样品水分大，就算是淡水湖也好，多余的水分会含盐。 暂停点：我曾经把步骤 12 的孵育时间延长超过 30min，甚至过夜，最终 RNA 依然完 好。我不建议每个样品都延长孵育时间，至少你的土样样品需要测试才能知道是否影响 RNA 质量。只在特殊情况下，你可以稍微在此步骤暂停。 5. 阴离子交换离心柱溶液自然滴下（步骤 15） 最后的 RNA 回收步骤使用的离心柱装有树脂，溶液利用重力通过离心柱。有时溶液 通过树脂的速度很慢，可适当施加正压加速流动。通常我们的做法是用 5ml 注射器针管 缓缓加压，但流速不应该超过 1 滴每秒。 6. 摇、摇，摇匀 SR5 和 SR6 （步骤15）： SR5 和 SR6 使用前必须充分摇匀。有些含有异丙醇的溶液静置会分层，使用前只要 充分摇匀即可。 7. 节省洗提时间小提示（步骤 19-20）： 有时候我会直接洗脱到 2ml Collection Tube，而不用 15ml Tube。确保离心柱垂直 放置不会倾覆。只有摸透了技巧才好这么弄，谢绝新手。 8. 最后异丙醇沉淀（步骤 20）：Final isopropanol precipitation (step 20): 从离心管中洗脱下来以后，加入异丙醇（SR4 溶液）