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第2章分子克隆工具酶 表2.1 常用工具酶与基因克隆技术 主要教学内容 教学要求 2.1 限制性核酸内切酶 2.1.1 限制性核酸内切酶的发现及其生物功能 1968年，Meselson and Yuan 从E. coli菌株Ｋ和Ｂ中发现了Ⅰ型限制酶； 1970年，Smith等人首先从流感嗜血杆菌d株中分离出HindⅠ和Hind Ⅲ 2.1.2 限制酶的分类与命名 三种类型限制酶的主要特性差异比较 限制酶的命名 1973年Smith和Nathams提出限制酶的命名原则，1980年Roberts对其系统化，如今简化成： H i n d Ⅲ，来源菌株 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 2.1.3 Ⅱ型限制酶的特性与DNA切割(1) 基本特性 EcoRI等产生的5’粘性末端 PstI等产生的3’粘性末端 Pvu Ⅱ等产生的平头末端 常用的限制酶及其识别序列和切割位点 2.1.4 影响限制性核酸内切酶活性的因素（酶切反应条件） (2) DNA样品的甲基化程度 (4) 核酸内切酶的缓冲液性质 II 型限制性核酸内切酶酶解反应的操作 Ⅱ 型核酸内切酶的多酶联合酶解 2.2 DNA连接酶 2.2.1 基本性质 (2)DNA连接酶反应条件 T4 DNA连接酶 2.3.1 E. coli DNA聚合酶 Ⅰ (DNA polⅠ) 基本用途 2.3.2 E. coli DNA聚合酶 I 大片段(Klenow) 基本用途 补平由核酸内切酶产生的5’粘性末端 DNA片段的同位素末端标记 cDNA第二链的合成 双脱氧末端终止法测定DNA序列 2.3.3 T4-DNA聚合酶 基本特性 5’→3’的DNA聚合酶活性和3’→5’的核酸外切酶活性； 在无dNTP时，可以从任何3’-OH端外切； 在只有一种dNTP时，外切至互补核苷酸暴露时停止； 在四种dNTP均存在时，聚合活性占主导地位。 基本用途 2.3.5 反转录酶 基本特性 2.4 修饰酶类 2.4.1 核酸酶 双链核酸外切酶：核酸外切酶 Ⅲ（ExoⅢ） 双链核酸外切酶：Ⅰ核酸外切酶(ⅠExo) 单链核酸内切酶：S1核酸酶 基本反应 基本反应 重要用途 单链内切双链外切的核酸酶：Bal31核酸酶 Bal31核酸酶的基本用途 2.4.2 碱性磷酸单酯酶 碱性磷酸酶的活性 注意 CIP的比活性比BAP的高出10～20倍 CIP在SDS中68℃就可完全失活 而BAP却是热抗性酶。 2.4.3 T4多核苷酸激酶 T4 多核苷酸激酶的活性（正向反应） T4多核苷酸激酶的交换活性 用　途 标记DNA的5`-末端； 使缺失5`-P末端的DNA发生磷酸化作用。 2.4.4 末端转移酶 末端转移酶(terminal transferase) 　　是末端脱氧核苷酸转移酶简称。来源于来自小牛胸腺、前淋巴细胞和分化早期的类淋巴细胞等。 功能 　　催化DNA片段，逐个将dNTP分子加到线性DNA分子3`-OH端， 合成方向，5’→3’。 末端脱氧核苷酸转移酶 （TdT ）特性 Mg2+催化作用 Co2+催化作用 用　途 主要用于给外源DNA片段和及载体分子加上互补同聚物尾巴； 标记DNA片段的3`末端。 本章应掌握的内容 工具酶的分类及用途。 限制酶分类及命名原则。 影响限制酶活性的因素有哪些？ 常见的DNA聚合酶及功能比较。 S1核酸酶，碱性磷酸酶，T4多核苷酸激酶，末端脱氧核苷酸转移酶的概念及功能。 切平由核酸内切酶产生的3’粘性末端 5’… G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G … 3’ 3’… C-G-A-G-P HO-A-C-G-T-C-C-T-C … 5’ T4-DNA聚合酶 5’… G-C-T-C- OH P-G-G-A-G … 3’ 3’… C-G-A-G-P HO -C-C-T-C … 5’ 注意：该酶也能降解双链DNA，只是其活性比单链降解活性低很多。 DNA片段的同位素末端标记 5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5’ 5’G-C-T-C A-G-C-T-G-OH HO-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5’ T4-DNA pol Mg2+ 5’ppp dN 5’ppp dA（a-32P-dATP） T4-DNA pol 5’G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G-T 3’ 3’C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C-A 5’ 从T7噬