HDAC6表达载体转染对胃癌细胞株SGC.docVIP

HDAC6表达载体转染对胃癌细胞株SGC7901生物学行为的影响 作者 作者单位 李光明 兰州大学临床医学院，甘肃 兰州 730000 卢启明　 甘肃省人民医院消化内科，甘肃 兰州 730000 0引言 肿瘤的发病机制十分复杂，近十余年来，组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylases，HDACs)在肿瘤发生中的作用已成为研究热点. 目前的研究多集中在Ⅰ类HDACs，认为其主要通过使核心组蛋白去乙酰化，导致染色质的空间构象由疏松型转为紧密型，从而引起某些肿瘤抑制基因转录抑制. HDAC6与肺癌、乳腺癌和口腔鳞癌等实体瘤的发生发展密切相关[1-3]，但有关HDAC6在胃癌发病机制中的重要作用，目前还少见文献报道. 本实验通过将HDAC6真核表达载体转染胃癌细胞SGC7901，使HDAC6过表达，观察其对胃癌细胞增殖及对常规化疗药物顺铂敏感性的影响，初步揭示HDAC6与胃癌发生的关系. 1材料和方法 1.1材料人胃癌细胞株SGC7901，BGC823(兰州大学医学实验中心提供);RPMI1640细胞培养基(美国Gibco公司);小牛血清(杭州四季青公司);胰酶、噻唑蓝(MTT)、二甲基亚砜(DMSO)、AnnexinvFITC凋亡检测试剂盒(美国Sigma公司);兔抗人HDAC6多克隆抗体(美国Cell Signaling Technology公司);SP免疫组化试剂盒(北京中杉金桥公司);G418(德国Merk公司);阳离子脂质体LipofectamineTM 2000(美国Invitrogen公司);顺铂(cisdiamminedichloroplatinum，CDDP)(山东齐鲁制药厂);HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG(美国匹兹堡大学艾军魁博士构建并惠赠，pCDNA3.1质粒具有新霉素抗性基因). 1.2方法 1.2.1细胞培养将胃癌细胞株SGC7901，BGC823分别培养于RPMI1640(含100 mL/L小牛血清、10万U/L青霉素、10万 U/L链霉素)细胞培养液中，置于37℃ 50 mL/L CO2培养箱中常规培养. 取对数生长期的细胞用于实验. 1.2.2免疫细胞化学取1 cm2盖玻片放入6孔板中，将对数生长期的胃癌细胞SGC7901，BGC823分别制成1×108/L单细胞悬液，每孔1 mL加入6孔板中，分别接种12孔，常规培养，细胞融合度达50%～60%时，小心移出玻片，PBS漂洗，750 mL/L乙醇固定. 按常规免疫细胞化学法分别检测HDAC6基因在两种细胞中的表达水平. 染色结果用计算机图像分析系统处理，自动记录吸光度A值，每张切片取5个视野,取A均值. 选取HDAC6表达水平相对高的细胞株作为进一步的实验对象. 1.2.3G418筛选浓度的确定密度为1×106/L的单细胞悬液按每孔1 mL接种于24 孔板,G418按0，100～1100 mg/L 的终浓度依次加入各孔中, 观察细胞的生长状况, 以第10日细胞全部死亡的最低浓度为G418的筛选浓度. 1.2.4细胞转染实验分为HDAC6表达载体pCDNA3.1HDAC6FLAG转染组(转染组)，空载体pCDNA3.1转染组(空载体转染组)及非转染组3组. 转染前按4×105个细胞/孔，在6孔板中接种对数生长期的胃癌细胞SGC7901，常规培养过夜. 细胞融合度达60%～80%时，更换无血清、无双抗RPMI 1640培养液,按LipofectamineTM 2000试剂盒说明书进行转染. 6 h后除去转染试剂，更换成常规培养液继续培养过夜. 转染后24 h，将细胞以1∶10的的比例传代至含G418(浓度为600 mg/L)的选择性培养液中继续培养，每周用该选择性培养液换液1次，8 wk后，随机挑取各组细胞克隆并扩大培养. 稳定转染后的各组细胞分别命名为SGC7901HDAC6+，SGC7901neo和SGC7901. 1.2.5Western Blot检测将对数生长期的胃癌细胞SGC7901HDAC6+，SGC7901neo和SGC7901细胞制成单细胞悬液，分别取6×106个细胞， 2000 r/min离心10 min, PBS洗2次. 裂解细胞, 以Bradford法测定细胞蛋白浓度. 将样品的蛋白浓度调整一致, 各取20 μL上样行SDSPAGE, 电泳后转至NC膜上, 含10 g/L脱脂奶粉的TPBS室温封闭2 h,加入HDAC6多克隆抗体(工作浓度为1∶1000)，室温孵育过夜， 再加入辣根过氧化物酶标记的羊抗兔二抗(1∶