分子生物学实验基础知识【荐】.pdfVIP

子生物学实验基础知识 子生物学是在生物化学基础上发展起来的，以研究核酸和蛋白质结构、功能 等生命本质的学科，在核酸、蛋白质 子水平研究发病、诊断、治疗和预后的 机制。其中基因工程（基因技术，基因重组）是目前分子生物学研究热点，这 些技术可以改造或扩增基因和基因产物，使微量的研究对象达到分析水平，是 研究基因调控和表达的方法，也是分子水平研究疾病发生机制、基因诊断和基 因治疗的方法。转化（transformation）、转染、转导、转位等是自然 基因 重组存在的方式，也是人工基因重组常采用的手段。基因重组的目的之一是基 因克隆 （gene clone），基因克隆可理解为以一 子基因为模板扩增得到的与 模板分子结构完全相同的基因。使需要 析研究的微量、混杂的目的基因易于 纯化，得以增量，便于分析。 外来基因引起细胞生物性状改变的过程叫转化（transformation），以噬 菌体把外源基因导入细菌的过程叫转染（transfection）。利用载体 （噬菌体 或病毒）把遗传物质从一种宿主传给另一种宿主的过程叫转导（transduction）。 一个或一组基因从一处转移到基因组另一处的过程叫转位（transposition）， 这些游动的基因叫转位子。 一、基因工程的常用工具 （一）载体 载体 （Vector）是把外源DNA （目的基因）导入宿主细胞，使之传代、扩增、 表达的工具。载体有质粒 （plasmid）、噬菌体、单链丝状噬菌体和粘性末端质 粒 （粘粒）、病毒等。载体具有能自我复制；有可选择的，便于筛选、鉴定的 遗传标记；有供外源DNA 插入的位点；本身体积小等特征。 质粒存在于多种细菌，是染色体 （核）以外的独立遗传因子，由双链 状D NA 组成，几乎完全裸露，很少有蛋白质结合。质粒有严紧型和松弛型之分。严 紧型由DNA 多聚酶Ⅲ复制，一个细胞可复制 1-5 个质粒。而松弛型由DNA 多聚 酶Ⅰ复制，一个细胞可复制30-50 个质粒，如果用氯霉素可阻止蛋白质合成， 使质粒有效利用原料，复制更多的质粒。质粒经过改造品种繁多，常用的有pB R322、pUC 系列等。这些质粒都含有多个基本基因，如复制起动区 （复制原点O ri），便于复制扩增；抗抗生素标记 （抗氨芐青霉素Apr、抗四环素Tcr 等）或 1 大肠埃希菌部 乳糖操纵子（E.coli LacZ）等，便于基因重组体的筛选；基因 发动子（乳糖操纵子Lac、色氨酸操纵子Trp 等）和转录终止序列，便于插入的 外源基因转录、翻译表达。质粒上还有许多限制性内切酶的切点，即基因插入 位点，又叫基因重组位点，基因克隆位点。 常用噬菌体载体有单链噬菌体M13 系统；双链噬菌体系统。噬菌体应和相 应的宿主细胞配合使用。以上载体各有特点，便于选择，灵活应用。 （二）工具酶 工具酶是基因重组技术不可缺少的工具。主要有限制性内切酶、连接酶、 核酸聚合酶、逆转录酶、核酸酶等。 限制性内切酶有Ⅰ型和Ⅱ型限制性DNA 内切酶之分，Ⅱ型能严格识别核酸 序列，并在识别区内特定的核苷酸处切开DNA 双链。故通常所指都是Ⅱ型限制 性DNA 内切酶。识别 四核苷酸和六核苷酸，其序列旋转对称。切口 开端和 粘端，产生3′－OH 和5′－P 末端。内切酶品种多，使用时应注意温 、缓冲 液用量（一般 1μg DNA/2-5 单位酶）等反应条件。 酶 识别序列 切口 Alu Ⅰ …AGCT… …AG CT… 四核苷酸 …TCGA… …TC GA… 平端切口 Eco R1 …GAATTC… …G AATTC… 六核苷酸 …CTTAAG… …CTTAA G… 粘端切口 连接酶有T4 噬菌体DNA 连接酶、T4 噬菌体RNA 连接酶、大肠埃希菌DNA 连 接酶等。DNA 连接酶可连接平端，也连接粘端。反应需有Mg2+和ATP 存在，pH7. 5-7.6。最适温 37℃，30℃以下活性明显下降，但考虑到