电化学发光一聚合酶链式反应方法检测胰腺癌中K-ras基因点突变.pdfVIP

第35卷 分析化学 (FENXIHUAXUE) 研究简报 第5期 2007年5月 ChineseJournalofAnalyticalChemistry 751~753 电化学发光一聚合酶链式反应方法检测 胰腺癌中K-ras基因点突变 朱德斌 邢达* 唐亚兵 周小明 (华南师范大学激光生命科学研究所暨激光生命科学教育部重点实验室，广州510631) 摘 要 发展了一种可用于快速检测胰腺癌中K-、癌基因点突变的电化学发光一聚合酶链式反应(ECL- PCR)分析方法。该法采用三联毗0钉标记的上游引物和生物素标记的下游引物对目的片段进行PCR扩增; 再采用限制性内切酶MvaI对扩增产物进行酶切。由于野生型样品和突变型样品间存在酶切位点的变化，其 中只有野生型样品能被切断;通过生物素与链霉亲和素包被的磁珠连接，将生物素标记的DNA片段收集到检 测池中，进行电化学发光检测。采用该法对13例胰腺癌组织中的K-ras癌基因第12位密码子进行点突变分 析，只需要10RL样品、20min孵育时间和30s采集时间，就可得出其中有12例存在点突变，点突变率为 92.3%。本方法操作简便、安全、快速、灵敏，可用于检测任何一种导致限制性内切酶位点改变的基因点突变。 关键词 电化学发光一聚合酶链式反应，胰腺癌，K-、癌基因，点突变 1 引 言 近年来，电化学发光(ECL)分析方法已被应用于核酸检测[1-41。该法通过测定标记在核酸上的三 联毗咙钉(Ru(bpy)3+)与三丙胺(TPA)反应所产生的光信号来实现检测’〔〕。 K-ras癌基因点突变与胰腺癌密切相关。研究报道，K-ras在胰腺癌中的突变率约为90%161，其密码 子12是发生突变的热点位置。检测该点突变对胰腺癌的诊断、预后及监测等都具有重要的临床价值。 本研究将聚合酶链式反应(PCR)技术和ECL分析方法结合起来，用于检测胰腺癌组织中K-ra、癌 基因密码子12发生的点突变，发展了一种安全、高效的基因点突变检测方法。 2 实验部分 2.1 材料和实验装置 人结肠癌SW480细胞(中国典型培养物保藏中心)，其K-ra、癌基因的密码子12已由GGT突变为 GTT;石蜡包埋的胰腺癌组织(广州中医药大学第一附属医院);上、下游引物序列分别为5=Ru(bpy)3+- gactgaatataaacttgtggtagttggacct-3’和5-Biotin-ctattgttggatcatattcgtcc-3，其中，上游引物的3末‘端 倒数第三位碱基处引人了一个错配碱基(带下划线碱基)，用于在扩增野生型样品时引人一个Mva1酶 切位点。引物合成及生物素标记均由上海生工进行，发光标记物Ru(bpy)3-NHSester的合成及标记 由本课题组进行。基因组抽提、纯化试剂盒，PCR扩增所需试剂及Mval限制性内切酶均购于上海生工。 三丙胺(TPA,98%)和链霉亲和素包被磁珠(小2.8Rm)分别购于美国Sigma公司和Dynal生物技术公 司。三轻甲基氨基甲烷一乙二胺四乙酸缓冲液(TE,pH=7.4)为本实验室自行配制。 ECL检测分析系统由本课题组自行设计。核心部分是检测池与超微弱光信号采集部分，密闭于暗 箱中。检测池为样品进行电化学发光反应的部位，产生的光信号通过光纤束传输，到达可进行单光子计 数的光电倍增管的光电阴极，转换成的电信号经过放大、甄别后，输出标准的TTL脉冲，经USB数据采 集卡计数后，由计算机软件Labview处理和显示[}70 2006-08-21收稿;2006-12-01接受 本文系国家自然科学基金(No30670507和广东省自然科学基金(No.015012)资助项目 *E-mail;xingda@scnu.edu.cn 分析化 学 第35卷 2.2 实验方法 采用ECL-PCR方法检测K-ra、癌基因点突变的基本原理如图1所示。用Ru(bpy)3‘标记的上游 引物和生物素标记的下游引物对，对K-ra、癌基因进行 PCR扩增，产生一段1