人脱氧胶原吡啶交联(DPD)酶联免疫吸附测定试剂盒使用说.pdfVIP

人脱氧胶原吡啶交联（DPD）酶联免疫吸附测定试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供体外研究使用、不用于临床诊断! 预期应用 ELISA法定量测定人血清、血浆、组织匀浆或其它相关生物液体中脱氧胶原吡啶交联（DPD）含量。 实验原理 用纯化的DPD抗体包被微孔板，制成固相载体，往微孔中依次加入标本或标准品、生物素化的DPD抗体、HRP 标记的亲和素，经过彻底洗涤后用底物（TMB）显色。TMB在过氧化物酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作 用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的DPD呈正相关。用酶标仪在450nm波长下测定吸光度（OD 值），计算样品浓度。 试剂盒组成及试剂配制 1、 酶标板：一块（96孔） 2、 标准品（冻干品）： 2瓶，请临用前15分钟内配制。每瓶以样品稀释液稀释至1ml，盖好后室温静置 大约10分钟，同时反复颠倒/搓动以助溶解，其浓度为20 ng/ml，然后做系列倍比稀释（注：不要直接在 板中进行倍比稀释），分别配制成20 ng/ml，10 ng/ml，5 ng/ml，2.5 ng/ml，1.25 ng/ml，0.625 ng/ml，0.312 ng/ml，样品稀释液直接作为空白孔 0 ng/ml。如配制10 ng/ml标准品：取0.5ml （不要少于0.5ml ）20 ng/ml的上述标准品加入含有0.5ml样品稀释液的Eppendorf管中，混匀即可，其余浓度以此类推。 3、 样品稀释液：1×20ml。 4、 检测稀释液A：1×10ml。 5、 检测稀释液B：1×10ml。 6、 检测溶液A：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液A 1:100稀释（如：10 检测溶液A / 990 检测稀释液A），充分混匀，稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制（100 /孔），实际配制时 应多配制 0.1-0.2ml。 7、 检测溶液B：1×120 /瓶（1:100）。临用前以检测稀释液B 1:100稀释。稀释方法同检测溶液A。 8、 底物溶液：1×10ml/瓶。 9、 浓洗涤液：1×30ml/瓶，使用时每瓶用蒸馏水稀释25倍。 10、终止液：1×10ml/瓶（2 mol/L H2SO4）。 11、覆膜：5张 12、使用说明书：1份 自备物品 1、 酶标仪（建议仪器使用前提前预热） 2、 微量加液器及吸头，EP管 3、 蒸馏水或去离子水，滤纸 标本的采集及保存 1、 血清：全血标本请于室温放置2小时或4 过夜后于1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清 置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。 2、 血浆：可用EDTA或肝素作为抗凝剂，标本采集后30分钟内于 1000 g离心15分钟，取上清即可检测， 或将上清置于-20 或-80 保存，但应避免反复冻融。 3、 组织匀浆：将动物的组织标本先用PBS洗涤，去除多余血液，匀浆化后放在20ml PBS中于-20℃放置 过夜，第二天，经过二次反复冻融破膜，将匀浆物5000x g离心5分钟，取上清即可检测。 4、 其它生物标本：请1000 g离心20分钟，取上清即可检测，或将上清置于-20 或-80 保 存，但应 避免反复冻融。 注：以上标本均应密封保存，4 保存应小于1周，-20 不应超过1个月，-80 不应超过2个月；标本溶血 会影响最后检测结果，因此溶血标本不宜进行此项检测。 操作步骤 实验开始前，各试剂均应平衡至室温，试剂不能直接在37 溶解；试剂或样品配制时，均需充分混匀，混 匀时尽量避免起泡。实验前应预测样品含量，如样品浓度过高时，应对样品进行稀释，以使稀释后的样品 符合试剂盒的检测范围，计算时再乘以相应的稀释倍数。 1、 加样：分别设空白孔、标准孔、待测样品孔。空白孔加样品稀释液 100 ，余孔分别加标准品或待测 样品100 ，注意不要有气泡，加样 时将样品加于酶标板底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀，酶标板 加上盖或覆膜，37 温育2小时。为保证实验结果有效 性，每次实验请使用新的标准品溶液。 2、 弃去液体，甩干，不用洗涤。每孔加检测溶液A工作液 100 （临用前配制），酶标板加上覆膜，37 温 育1小时。 3、 弃去孔内液体，甩干，洗板 3次，每次浸泡1-2分钟，大约400 /每孔，甩干（也可轻拍将孔内液体 拍干）。 4、 每孔加检测溶液B工作液（临用前配制）100 ，加上覆膜，37 温育1小时。 5、 弃去孔内液体，甩干，洗板5次，方法同步骤3。 6、 每孔加底物溶液90 ，酶标板加上覆膜37 避光显色（反应时间控制在15-30分钟，当标准孔的前3-4 孔有明显的梯度蓝色，后3-4孔梯度不明显时，即可终止）。 7