人血浆DNA双重实时荧光定量PCR检测法建立3.pdfVIP

　临床检验杂志 2007年第 25卷第 3期 　Ch ine se Jou rnal of Clin ical L aboratory Science, 2007 , Vol25,No3　 177 文章编号 : 100 1764X (2007)　　中图分类号 : Q503　　　文献标识码 : A ·论著 · 人血浆 DNA 双重实时荧光定量 PCR 检测法的建立 ( ) 陈丹 ,潘世扬 ,张丽霞 ,高丽 ,谢而付 ,黄 ,戎国栋 南京医科大学第一附属医院临床检验中心 ,南京 2 10029 摘要 : 目的　建立带有内参照的双重实时荧光定量 PCR 方法检测血浆 DNA 含量 。方法 　构建重组质粒 DNA 作为内参照物 , β 采用共用下游引物的双重实时荧光定量 PCR 技术同步扩增人看家基因 actin和重组质粒载体中人工合成 DNA 序列 ,定量检 测健康成年人血浆 DNA 含量 。结果 　本法能在同一个反应管中对 目的基因和内参照进行同步扩增 ,两者的扩增无相互干扰 , β ( ) 特异性好 ;重组质粒 DNA 的平均扩增效率达 90% , actin基因的平均扩增效率接近 100% ;本法批内变异系数 CV 11 % ,批 间 CV 17% 。结论 　成功建立含有内参照的双重实时荧光定量 PCR 方法 ,可对血浆 DNA 进行定量检测 。 关键词 :血浆 DNA ;实时荧光定量 PCR;双重 PCR 　　目前血浆 DNA 定量检测方法虽然很多 ,但各报 g/L 聚丙烯酰胺凝胶电泳验证 。将上述 4 1 bp 人工 道间存在较大差异 ,缺乏公认的标准化方法 。本研 DNA 双链与质粒载体重组 ,经克隆扩增后 , 回收重 究通过构建人工重组质粒 DNA 作为内参照 , 以人看 组质粒 DNA ,操作步骤按参考文献 [ 1 ] 进行 。紫外分 β 家基因 actin 为 目的基因 ,建立血浆 DNA 双重实 光光度法对重组质粒 DNA 精确定量 ,梯度稀释获得 时荧光定量 PCR 检测方法 。 8 7 6 5 4 μ 10 、10 、10 、10 、10 cop ie s/ l 的质粒 DNA 标准 1　材料与方法 品。 1. 1　血浆标本 　体检健康者 60 例 ,男 30 例 ,女 30 表 1　荧光定量 PCR 引物及 TaqM an探针 例 ,年龄 23 ～59 岁 ,平均 42 岁 。采集 ED TA 抗凝静 引物 / 长度 脉血 2 m l, 1 800 ×g 室温水平离心 10 m in ,吸取上清