rhEPO-Fc融合蛋白的表达、纯化和质量研究.pdfVIP

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００７，２７（６）：６～９ ｒｈＥＰＯＦｃ融合蛋白的表达、纯化及质量研究 ? １，２ １ １ １ １ １ ２ １ 杨建军 　张昕竳 　周　洁 　龚　振 　陶　群 　叶　丹 　汪世龙 　鞠佃文 （１上海美恩生物技术有限公司　上海２０１２０３　２同济大学生命科学与技术学院　上海２０００９２） 摘要　用无血清培养基培养分泌表达ｒｈＥＰＯＦｃ融合蛋白的工程细胞株ＭＹ０６（ＣＨＯ细胞），收集 ? 发酵培养上清，通过离心、过滤、亲和层析、离子交换层析、分子筛等方法对目的蛋白进行纯化，通 过ｌｏｗｒｙ法、ＳＤＳＰＡＧＥ、Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ、ＨＰＬＣ、ＥＬＩＳＡ及 ＩＥＦ等方法研究目的蛋白质量，以建立 ? ? ｒｈＥＰＯＦｃ融合蛋白的发酵、纯化工艺，并探寻该融合蛋白的质量检测方法。通过该工艺，ｒｈＥＰＯ ? ? Ｆｃ蛋白表达量高达２ｇ／Ｌ，蛋白纯化得率达４５％以上，纯度可达９８％以上，相对分子质量约为 ６０ｋＤａ，ｔ长达３８ｈ，免疫印迹证明具有天然ＥＰＯ的免疫原性。研究结果表明该生产工艺可获得 １／２ ｒｈＥＰＯＦｃ的高效表达，纯化得率高，质量检验方法稳定可靠，适用于大规模生产。 ? 关键词　重组人促红细胞生成素　免疫球蛋白Ｆｃ段　融合蛋白　发酵纯化工艺　质量研究 中图分类号　Ｑ８１６ 　　促红细胞生成素（ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ，ＥＰＯ）主要是由肾 Ｆｃ融合蛋白表现出的体外药物代谢动力学特性 同源， 脏分泌的一种活性糖蛋白，能促进骨髓中红系造血祖 与同类型的人ＩｇＧ相当。这种制备融合蛋白的方法已 用于一些重要的细胞因子（如 ＩＬ２和ＩＦＮａ２ａ）和可溶 细胞的增殖、分化及血红蛋白合成。ＥＰＯ主要来自肾 ? ? ［１］ ［４，５］ 性受体（如ＴＮＦＲｃ和 ＩＬ５Ｒｃ） ，由此制备的一些 脏，极小部分来自肝脏 。天然存在的ＥＰＯ药源极为 ? ?? 匮乏，必须从贫血病人的尿液中提取，不能满足临床需 药物已成功地使用在临床上并用于治疗一些特定疾病 求。１９８５年ＥＰＯ基因克隆和表达成功，使ｒｈＥＰＯ大规 如类风湿性关节炎等。 模生产成为可能。ｒｈＥＰＯ已广泛用于治疗肾功能衰竭 　　将编码人 ＩｇＧＦｃ段的基因与编码人 ＥＰＯ的基因 性贫血、肿瘤化疗后贫血、艾滋病患者接受治疗导致的 片段连接，并将其克隆至高表达质粒载体中，用该质粒 贫血及用于手术前自体贮血避免感染血源性疾病等， 转染ＣＨＯ细胞，通过ＭＴＸ（氨甲蝶呤）加压筛选获得高 表达工程细胞株ＭＹ０６，利用无血清培养基培养工程细 在临床上产生了良好的社会效益和经济效益。然而， 胞株 ＭＹ０６进行 ｒｈＥＰＯ Ｆｃ融合蛋白的大量表达。 ｒｈＥＰＯ制剂在人体内血清循环半衰期仅为４～８ｈ，临床 ? ｒｈＥＰＯＦｃ融合蛋白的结构示意图如图１所示，人免疫