小檗碱对胰岛β细胞功能的影响和其衍生物抗糖尿病活性的研究.pdf

DISSERmmoNOFP11．D． Chinese ofMedical UnionMedical Academy SciencesPekingCollege 摘要 糖尿病是以血糖增高为主要表现的累及全身的代谢性疾病，但血糖的增高仅发 生在胰岛p细胞功能受损、衰竭时。近年来，p细胞功能的研究已成为糖尿病研究 的重点方向，而其内容主要包括胰岛素分泌及胰岛素合成两方面。随着糖尿病研究 理论的更新以及新的作用机制的不断发现，抗糖尿病药物也从最早的以“竭泽而渔” 式的刺激胰岛素分泌降低血糖为目的，发展为以通过降低血糖、调节血脂、改善胰 岛素抵抗、缓解并发症并抑制13细胞凋亡达到多方位综合治疗糖尿病为目标。而保 护p细胞功能则成为抗糖尿病药物研究的热点。小檗碱是中药黄连中的主要生物碱， 其抗糖尿病作用多年前已被报道。近年来又发现其具有降低血甘油三酯及胆固醇的 作用，并可能促进GLP-1的分泌，提示其进一步开发应用的价值很大。关于小檗碱 对外周胰岛素敏感组织的作用机制研究较多，但其对胰岛p细胞功能的研究鲜见， 本论文以考察小檗碱对胰岛13细胞功能的影响为目的，重点研究其对胰岛素基因表 达的影响，并研究小檗碱结构修饰的化合物的抗糖尿病活性。 论文第一部分考察了盐酸小檗碱(50 mg／kg)对代谢综合征动物模型MSG小 鼠及2型糖尿病动物模型C57／BL小鼠的抗糖尿病活性并初步评价了其在整体水平 对胰岛B细胞的影响。实验结果显示，在两种小鼠模型，盐酸小檗碱能够显著改善 动物的胰岛素抵抗状态及葡萄糖耐量异常状态；降低空腹血清胰岛素水平；有降低 小鼠胰腺脂质积聚的趋势。这些结果提示小檗碱通过改善糖脂代谢，减轻了糖脂对 p细胞的毒性作用，对p细胞发挥有益作用。胰岛病理切片结果显示盐酸小檗碱能 够延缓C57／BL小鼠胰腺组织病变进展，维持p细胞形态；两种动物模型的胰岛素 免疫组织化学染色均显示动物胰岛内胰岛素含量降低，提示小檗碱对胰岛p细胞胰 岛素表达可能存在直接的调控作用。 在第一部分研究结果的基础上，论文第二部分进行体外实验，主要目的是考察 盐酸小檗碱对胰岛13细胞的胰岛素水平是否具有直接调节作用并探讨其机制及意 time 义。实验中通过Real PCR的方法证明了盐酸小檗碱对胰岛B细胞系NIT-1细 胞及正常ICR小鼠原代胰岛内胰岛素基因Ins．1及Ins．2表达产生抑制作用，并且 这种表达抑制作用在蛋白水平亦能够体现。为了进一步研究盐酸小檗碱对胰岛素基 因表达的调控机制，本部分论文中建立了考察胰岛素基因启动子活性的研究方法。 实验中通过应用不同浓度的葡萄糖、软脂酸及阳性参照药物exendin-4，证明所构 建的两种报告基因质粒对于调节胰岛素基因表达的生理性物质及外源性药物反应 敏感准确，证明该方法可用于进一步考察药物对启动子的调控。随后的实验中应用 所构建的质粒考察盐酸小檗碱的作用，结果显示，盐酸小檗碱对胰岛素基因启动子 活性具有抑制作用，这种抑制作用存在明显量效及时程关系，并与文献中与其作用 DISSERTAllONOFPh．D． Chinese ofMedical UnionMedical Academy Sciences＆PekingCollege 机制相似的药物盐酸二甲双胍存在较明显的差别。本部分最后进行了信号通路的研 C能够阻断小檗碱 究及功能意义的初步探讨，结果显示AMPK抑制剂Compound 对胰岛素基因表达的下调作用，提示小檗碱对胰岛素基因表达的调控依赖于此通 路。RealtimePCR还显示小檗碱能够降低内质网应激通路关键蛋白CHOP的 mRNA表达，提示其可能通过缓解内质网压力改善13细胞功能。转录因子mRNA 水平测定表明，Pdx．1可能参与小檗碱对胰岛素基因表达的调节。 国内已有报道以小檗碱化学结构为先导化合物，通过研究其衍生物发现调脂作 用更好的化合物，从而提示此方面研究的重要意义。论文第三部分首先应用葡萄糖 消耗实验，测定系列小檗碱衍生