发酵罐操作与发酵过程中主要生化指标测定.docVIP

小型发酵罐的使用与发酵过程中主要生化指标测定 华南农业大学 ?为研究小型发酵罐分批培养过程中大肠杆菌的菌体生长状况，本实验以分批培养法培养大肠杆菌，通过控制发酵过程的温度、溶氧、搅拌速度、空气流量、泡沫水平等参数，并每小时取样测OD值和还原糖量，制作菌体生长曲线，以此判断大肠杆菌的生长发酵状况。结果表明大肠杆菌在发酵的前三个小时处于生长延迟期，发酵3～6小时为对数生长期，发酵6小时后该菌开始进入平衡期，第8小时时结束发酵实验。 发酵罐是进行液体发酵的特殊设备。生产上使用的发酵罐容积大，均用钢板或不锈钢板制成；供实验室使用的小型发酵罐，其容积可从约1L至数百升或稍大些。一般来说，5L以下是用耐压玻璃制作罐体，10 L以上用不锈钢板或钢板制作罐体。发酵罐配备有控制器和各种电极，可以自动地调控试验所需要的培养条件，是微生物学、遗传工程、医药工业等科学研究所必需的设备[1]。 在当今市场上，各厂家生产的发酵罐会有所差别，但基本原理是相同的，基本结构是类似的。本实验使用的是BIOTECH-7BGZ发酵罐，其结构主要又罐体和控制器两大部分组成，罐体为一硬质玻璃圆筒，底和顶两端用不锈钢板及橡胶垫圈密封构成，容积为5L，顶盖上有多个孔口，分别是加料及接种口补料口、放置 DO（溶解氧）电极口、放置pH电极口、放置消泡电极口、放置取样管口等[2]；本罐可配置不同性能的控制器，控制器能完成最基本的功能，它由下列几部分构成： 参数输入及显示装置，用以输入控制发酵条件的各种参数及显示发酵过程中罐内培养液的温度，pH、DO（溶氧）的测定数值。 碱泵和酸泵分别用以向发酵罐加入碱液和酸液以调节培养液中的pH； 消泡剂加入泵用以向发酵罐加入消泡剂，以消除发酵过程中产生过多的泡沫。 自动或人工控制按钮用以决定本控制器是处在自动控制或人工控制状态。 电极连接导线：有三条连接导线，分别与pH、DO和AF（消泡）电极连接。 1．材料与方法 1.1 实验材料 1.1.1 菌种 大肠杆菌（E.coil） 1.1.2 培养基配方 种子培养基：葡萄糖1.0g，蛋白胨1.0g，酵母膏0.5g，牛肉膏1.0g，氯化钠0.5g，水1000mL，pH7.0。 发酵培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，酵母膏5g，牛肉膏10g，氯化钠5g，氯化铵5g，水1000mL，pH7.0。 1.1.3 仪器设备 BIOTECH-7BGZ发酵罐一套（配套蠕动泵、pH电极、溶氧DO电极、空压机及所有连接管）、光光度计、旋转式摇床、离心机、冷藏箱、滴点装置、电子天平、电磁炉等。 1.1.4 用具 烧杯、三角瓶、量筒、保鲜膜、玻璃棒、比色杯、试管、离心管、移液管、波珠等。 1.1.5 试剂 泡敌、婓林试剂、0.1%标准葡萄糖溶液、40%氢氧化钠等。 1.2 实验方法 1.2.1 菌种准备 1.2.1.1 配制种子培养基 配制种子固体培养基100mL，分装试管，0.1MPa（121）灭菌20min，然后摆成斜面。 配制种子培养液500mL，各分装50mL于两个250mL三角瓶中（作一级种子瓶），余下的培养液装进三个500mL的三角瓶中（作二级种子瓶），0.1MPa（121）灭菌20min。 1.2.1.2 接种与培养 上罐前两天，从冰箱中取出菌种转接斜面，37培养24h。 上罐前一天，由斜面菌种转接一级种子瓶，37振荡（125r/min）培养12h，然后转接二级种子瓶，37振荡（125r/min）培养10h。 1.2.2 上罐前的准备及实罐灭菌 洗净发酵罐及各联接胶管。 配制发酵培养基4000ml，置发酵罐内，视情况加入几滴泡敌。 安装好发酵罐，把取样管、电极插口、补料口、消泡剂料瓶等固定、密封好后，开夹套溢流口V2、进水阀W1，使夹套充满水。 用保护罩盖住罐盖及发酵罐，用倾倒螺钉锁紧法兰，开保护罩顶部排气阀V4，启动蒸汽发生器，启动搅拌马达，调转速300r/min，开启冷凝水出水阀V1，开进水阀门S1，进行在位灭菌。 将灭菌温度设为115，保温时间0.33h，设为自动。当达到795s时，灭菌温度达到121。 灭菌结束后，不打开保护罩，使发酵罐自然冷却至室温。 用75%酒精消毒pH电极和DO电极，接入发酵罐，连接各电极导线。 流加碱的管线与泵和罐体连接，通过面板操作开关选择碱泵，打开手动开关，使胶管内充满液体，将输出上限设为15%，下限设为0，待一切准备就绪，将“手动”开关调节到“自动”状态。 设定搅拌转速为300r/min，空气流量2~3L/min、pH7.0、DO100%，系统进入发酵状态。 1.2.3 发酵操作 当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后，取样（用于接种前培养基成分分析）：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料