贯叶连翘提取物对免疫性心肌炎小鼠治疗作用的机理与探讨.pdfVIP

贯叶连翘提取物对免疫性心肌炎小鼠治疗作用的机理探讨* 1△ 1 2 李 乐 ，张益灵 ，陶厚权 ( 1. 浙江工业大学药学院，杭州 310032； 2. 浙江省人民医院中心实验室, 杭州 310014 ) 【摘要】目的：探讨贯叶连翘提取物治疗小鼠免疫性心肌炎的机理。 方法：猪心肌球蛋白 免疫BALB/C小鼠,建立免疫性心肌炎模型。免疫组化法检测心肌组织穿孔素、颗粒酶B的蛋白 表达，测定心肌中一氧化氮（NO）含量、血清中超氧化物歧化酶(SOD)、丙二醛(MDA)含量。 结果：贯叶连翘提取物抑制心肌穿孔素和颗粒酶B表达，降低NO、MDA 水平，提高SOD 活性。 结论 : 贯叶连翘提取物通过提高抗氧化能力，阻断脂质过氧化，影响穿孔素/颗粒酶表达， 发挥治疗小鼠免疫性心肌炎作用。 【关键词】贯叶连翘提取物；免疫性心肌炎；穿孔素；颗粒酶； 【KEY WORDS 】 Hypericum Perforatum extractive；immune myocarditis； Perforin；granzyme. 【中图分类号】R 285.5 【文献标识码】A 【文章编号】1000-6834（2013）-- 大量基础与临床研究表明，病毒性心肌炎（viral myocarditis，VMC）发病期间，自 身免疫反应在其发生发展中起重要作用，免疫性心肌炎发病机制同VMC第二期（免疫损伤期） [1] 相似 。 本课题前期研究发现，用猪心肌球蛋白免疫 BALB/C 小鼠,建立免疫性心肌炎模型，贯 叶连翘提取物（Hypericum Perforatum extractive,HPE）能抑制小鼠脾脏组织, 降低外周 血 T 淋巴细胞 CD4/CD8 比例和血清肌球蛋白自身抗体滴度,减轻心肌内淋巴细胞浸润，可治 疗小鼠免疫性心肌炎。 本课题通过上述方法，建立免疫性心肌炎的模型，测定心肌中NO含量和血清中超氧化 物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)、丙二醛(Malondialdehyde,MDA)含量，结合免疫 组化法检测心肌组织穿孔素(perforin,又称成孔蛋白pore-forming protein,PFP)、颗粒酶 B(granzyme) 的蛋白表达，进一步探讨HPE治疗免疫性心肌炎的作用机制。 1 材料与方法 1．1 实验动物 __________________________________________ * 【基金项目】 浙江省教育厅科研重点项目基金资助（Z200908565）;浙江工业大学校科研基金重点项目 (X1168117) 【收稿日期】 【修回日期】 △ 【通讯作者】 E-mail:lile_1856@163.com 4 周龄BALB/C 小鼠，体重 13～15g，雄性，浙江省医学科学院实验动物中心提供。 1．2 材料与仪器 猪心肌球蛋白(M-0531),弗氏完全佐剂,Sigma 公司;小牛血清，HRP标记的羊抗小鼠 IgG，TMB显色剂，上海泽衡生物技术有限公司；SOD、MDA、NO试剂盒,南京建成生物工程研 究所；PFP兔抗单克隆抗体，美国Santa Cruz公司；颗粒酶B兔抗单克隆抗体，美国Lab Vision 公司。组织芯片制备系统二次包埋仪，恒泰科技发展有限公司。 1．3 实验方法 造模分组:小鼠随机分为：正常对照组（n=15），实验性自身免疫性心肌炎（experimental autoimmune myocarditis, EAM）组（n=50）。EAM BALB/C 小鼠组于实验当天，双侧腹股沟 皮下各注射猪心肌球蛋白乳化液（浓度为 1 mg/ml）0.1 ml;实验第 7 天，在同部位同剂量 再次进行免疫。正常对照组：同时间同部位注射等体积生理盐水，进行假性免疫。 用药分组: 实验第21 天，EAM模型组 44 只小鼠存活。随机分为: EAM 模型组；HPE 20 mg/kg 组，HPE50 mg/kg 组，HPE100 mg/kg 组，均分别灌胃给药，每天 2 次;对照组和 EAM 模型组灌胃给予等体积生理盐水，共 6 周。 标本采集和处理:实验第 60 天，各组随机取 10 只小鼠眼眶取血 0.5 ml，离心（3000 r/min，10 min），收集血清，-20 °C保存备用；另各组随