用酶联免疫吸附试验法检测印楝愈伤组织中印楝素含量.pdfVIP

维普资讯 第19卷 第4期 热 带 作 物 学 报 Vo1．19 No．4 1998年l2月 CHINESE JOURNALOF TROPICALCROPS Dec．1998 用酶联免疫吸附试验法检测印楝 愈伤组织中的印楝素含量 1p——朱西懦雷光富L一，海保刘卫张云开 厂 植物研究所 广州 570650 ／ (中国科学院华南植物研究所广州 ) 7／乙、 摘要 用双抗体夹心法酶联免疫吸附试验(DAS—ELISA)检测印楝(Azad~vacMaiadicaA．Juuss)愈 伤组织中的印楝紊含量，成功建立了DAS—ELISA。以牛血清蛋白为载体，用二环己基碳二亚胺合成 免疫原，制备抗血清，获得效价为1：2560。以辣根过氧化物酶为标记酶，用“过碘酸盐氧化法 合成酶 标抗体。使用包被抗体的最适浓度为5．0~g／mL，标记抗体浓度为2．5~g／mL。可测抗原最低浓度为 10~g／mL。此方法简便，快速，灵敏，专一性强，用量少，且不需要预先纯化，适合于植物组织和细胞培 养物中有效活性成分测定，可用于大规模理想细胞系筛选。 耋中圈法分娶再譬_i 一盟一—鬯堕一童 殇毋；寤，， 大量培养植物组织和细胞进行 目的物含量测定或者高产细胞系筛选，首先遇到的问题是如 何测定培养细胞中的目的物含量 。目前，次生物质成分的检测方法是先 目测或将目的物分离、 纯化，然后再用TLC、TPLC、质谱法或其它方法分析。目测仅适用于区分有色 目的物，而且很不 准确。后一类方法成本高，费时，需较昂贵的仪器设备，样品制备量大，测定程序繁琐，不适于大规 模的植物细胞筛选使用。因此，寻找并建立快速、精确、简便的测定方法是一个较为重要的问 题 。免疫技术已应用于植物小分子组分测定，例如放射免疫试验 (RIA)[1l，已作为植物次生 代谢物质测定的内容之一。本研究用 “双抗体夹心法 酶联免疫吸附试验 (DAS—EL／SA)，测试印 楝愈伤组织中的印楝素含量，从而，建立一个快速，特异性强．灵敏度高的印楝素检测程序。 1 材料和方法 1．1 印檬素完全抗原的翩备 由于分子量小于l000道尔顿的物质都需要连接到一个本身具有免疫原性的载体物质(如牛 血清蛋白BSA)上，才能够诱导动物淋巴细胞产生相应特异性抗体，并通过半抗原分子的羧基与 BSA上的氨基反应而交联。根据文献E3]的方法，将500mg纯度为90 的印楝素溶于10mL无 水二氧六环中，加入270mg二环己基碳二亚胺，具体步骤如图l所示。 1．2 抗血清的制备、效价测定及抗体纯化 1．2．1佐剂和配制方法 (1)Freund不完全佐剂：液体石腊和羊毛脂混合 (9：1)，然后高压灭菌。使用前与抗原等量 混合，用注射器充分乳化。 车研究系华南生物工程研究开发中心基金资助项目。 收穑 日期{l997—08—15 维普资讯 4期 朱西儒等：用酶联免疫吸附试验法检测印楝愈伤组织中的印楝素含量 67 500mg印楝素 酶(RZ3．0)10mg +1OmL无水二氧六环 l +1．0mL蒸馏水 +270mg二环己基碳二亚胺 I +1．0mL0．06mol／LNaIO 搅拌 静置 J 4℃ 30min． ● 30rain． + lmL 0．16mol／L PEG 30min 广— — 离心 。 +