神经元蛋白质磷酸化修饰分析方法初步研究.pdfVIP

JSich¨u大an学Un学iv(Med医S学ciE版di)；2…004”；35(5)…．7l5…．7l8 神经元蛋白质磷酸化修饰分析方法的初步研究 何 涛，李 洪 ，李蓉晖。，段承月0，甘 淋，李 娟 ，宋 杰 1．泸州医学院基础 医学院 分子生物学实验室 (泸州 646000)；2．泸州医学院基础医学院 生物化学教研室 l 3．四川大学基础医学与法医学院 生物化学教研室 【摘要】 目的 建立一种对神经细胞中的磷酸化蛋白质进行分离分析的方法 。方法 培养新生乳小鼠神经细 胞 ，加入”P—NaH。PO．2．78×10Bq／ml，37℃孵育 1．5h。刺激组分别加入表皮生长因子(EGF)20ng／ml或胰岛素 100nmol／L，对照组加入等量的培养基，作用不同时间后液氮终止反应。裂解细胞 ，用 Bio—RadDCProteinAssay kit测定细胞蛋白质含量 ，双向电泳分离细胞蛋白。放射 自显影。结果 ①双向电泳 自显影 图谱显示近数十个蛋白 质斑点 ，绝大部分集中于pH偏酸性和中性区域 ，pH4．6～6．5，其相对分子质量主要介于20×10。～130×10之 间。 ②EGF、胰 岛索刺激不同时间后虽出现有磷酸化蛋 白质斑点的增加或消失，但更多表现为某些磷酸化蛋白质斑点 灰度的增强或减弱。③ 对 比分析发现 ，放射 自显影图谱 中只有少数斑点出现在双向电泳 CoomassieBrilliantBlue R一250染色图谱中，提示神经细胞中的大多数磷酸化蛋白质为低丰度蛋白。结论 采用本研究建立的双向电泳和 放射 自显影技术可对神经细胞 中的蛋 白质可逆磷酸化修饰状态进行较为全面、动态的分析 ，方法灵敏、特异性强， 可为细胞信息传递功能蛋白质组的研究奠定了基础。 【关键词】 磷酸化修饰 双向电泳 放射 自显影 蛋白质组 【中图分类号】 Q51 ANewApproachtoProteinPhosphorylationModificationAnalysisforNeuron HETao，LIHong，LIRong-hui， DUAN Cheng-Gang，GAN Lin，LIJuan，SONG Jie． MolecularBiology Laboratory，Luzhou M edicalCol~ge， Luzhou，646000，China ／Abstract】 Objective Todevelopanew methodforanalysisofproteinphosphorylationmodificationin culturedneuron．M ethods Culturedneuronswerepre-incubatedinDMEM withoutsodium phosphatefor15min todepletethemetabolicpools．Neuronswerethenlabeledwith[。。P3orthophosphate(2．78×10B‘q／m1)for1．5h and stimulatedbyeitherinsulin(100nmol／L)，EGF(20nm ／L)orsalinefor0，5，20，60，120min．Reactions wereterminatedbyfreezingneuronsinliquidnitrogenpriortothesolubilizingofthem inalysisbuffercontaining 8mol／Lurea，4A~CHAPS，2％Bio—lyte，pH 3-10，2mmol／LTBP．Proteinconcentrationsweredeterminedwith Bio-RadDC ProteinAssaykit．The ”P—labledlysatesisoelectricallyfocusedonIPG DrystrippH 3-10orpH 4-7 Lineargelsweresubsequentlyseparated insecond-dimensionalSDS—PAGE．Thedriedgelwasautoradiographed for 5daysat 一 70 ℃ wit