研-基因操作3.ppt

核 酸 操 作 DNA, RNA 提取， 分离纯化， 检测等 2、采用离子型表面活性剂使膜蛋白和核蛋白变性，游离DNA; 新鲜组织DNA的提取： 　胃粘膜组织约0.2 g，将其剪碎，加入DNA提取液(Sucrose、20×SSC、10% SDS、500 mmol.L-1 EDTA)和蛋白酶K，置37℃水浴中振荡24h，用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提2次，加入醋酸钠，冷无水乙醇沉淀DNA，再加入TE缓冲液使DNA溶解。次日用RNA酶作用3～4h，重复抽提、沉淀DNA步骤，进一步纯化DNA。 3.用酚/氯仿/异戊醇纯化 加入3 mol.L-1醋酸钠及无水乙醇，DNA成絮状物沉淀，离心，用70%乙醇洗DNA 2次，空气干燥5 min，加入适当体积TE缓冲液，置4℃/ -20℃冰箱保存。 二、RNA提取 提取RNA的材料： RNA是基因转录产生，不同组织在不同时期有特定的基因表达，因此，提取RNA的材料取决于所分析基因表达的组织。 RNA可以通过异丙醇沉淀来还原 组 织 RNA 提 取 主要步骤： 将新鲜或冷冻的组织块切碎，迅速加入异硫氰酸胍/酚溶液中匀浆，再加入1/10体积氯仿，剧烈混合，离心分离有机相和水相，收集含 RNA 的水相，再用异丙醇沉淀RNA。 细胞总RNA的提取 1 6孔板细胞，取出无菌室，去其上清，用PBS洗两次后，每孔加TRIZOL试剂1 ml，摇匀，无菌罩内消化3-5分钟（观察：液体变粘稠，细胞脱壁）。 2 将各孔内消化好的细胞裂解液吸到DEPC处理过的1.5 ml EP管中，加新开的氯仿0.2 ml，轻摇15秒。DEPC：焦碳酸二乙酯，RNA酶的强抑制剂 3 室温静置2-3 min后，12000 rpm，15 min，4℃，离心。然后取上清水相（约0.6 ml）到 EP管（DEPC处理过），加0.5 ml新开的异丙醇，室温下静置10 min 。 4 离心：12000 rpm，10 min ，4℃，。总RNA在管底成白色沉淀，弃上清（小心别丢了沉淀），75%乙醇洗涤（用DEPC水新配制），7500 rpm，5 min，4℃离心。 5 去上清，风干沉淀5-10分钟min ， 加入20-30 ul DEPC处理水，55-60℃水浴10 min溶解总RNA，保存备用。 三、质粒 DNA 的提取和纯化? 载体和基因绝大多数是以质粒的形式保存在大肠杆菌里 质粒： 独立于细菌染色体之外 的小双链闭合环状DNA。 质粒的提取和纯化 碱裂解法：????????溶液Ⅰ：悬浮细菌，50mM 的葡萄糖。????溶液Ⅱ： 0.2N NaOH 和 1% SDS ，pH12.0-12.5 。破裂细菌，使混浊的细胞悬液变成完全澄清的粘稠液体。线性染色体DNA发生变性，质粒DNA不变性。????溶液Ⅲ： 醋酸钾缓冲液 （3M, pH4.6）。染色体DNA复性并聚积成不溶的沉淀，同时高浓度的盐引起蛋白质与 SDS 复合物以及大分子的 RNA 形成沉淀。 质粒的提取和纯化 步骤： 1 离心收集菌液（5000-10,000 g），弃上 清，控尽； 2 加溶液 I（菌液体积的1/10），悬浮菌体； 3 加溶液Ⅱ,混匀； 4 加溶液Ⅲ，倒转混匀； 琼脂糖凝胶电泳 检测 DNA 是否降解，以及DNA 经限制性内切酶酶切后产物的大小。 琼脂糖：海藻提取物，不同琼脂糖浓度分离片段不等的 DNA 。 上样缓冲液：将 DNA 样品沉入到点样孔内，使样品不易扩散；含有溴酚兰等指示剂，可观察电泳的进程。 ?电压： DNA 带负电，泳动方向是从负极走向正极。一般电场大小为5 伏 / 厘米。 染色：溴化乙啶（ethidium bromide,EB)可掺入到双链 DNA 中，在紫外光的激发下发出橙红色的荧光，用于对 DNA 进行染色和观察。 核酸的电泳检测 质粒 DNA 构型： 有三种，即闭合环状超螺旋 （supercolied,SC）、缺口环状 （open circles,OC）和线状(linear,L)，泳动速率不同。 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） ?分离 100bp-1kb 大小的核酸分子，对单链核酸来说，其分辨率可达 1bp 。????由丙烯酰胺和N，N- 亚甲双丙烯酰胺经聚合而成的高分子聚合物，其聚合度由浓度和二者的比例决定。 主要用来检测小分子核酸的大小，或在同位素标记的情况下分析单链核酸，如分离寡核苷酸探针、 S1 核酸酶产物分析和 DNA 测序等。 SDS(protein) P C R 以拟扩增的DNA分子为模板，通过分别与模板5’端和3’端互补的两个引物，在DNA聚合酶的作用下，按半保留复制机制进行引物延伸，重复这一过程，使目的DNA片段得到