庆大霉素脂质体同种异体骨的制备及体外抑制金黄色葡萄球菌生物膜及研究.pdfVIP

庆大霉素脂质体同种异体骨的制备及体外抑制金黄色葡萄球菌生物膜的研究 唐辉 徐永清 马涛 周田华 李军 丁晶 成都军区昆明总医院全军骨科中心 摘要 目的：由于细菌生物膜常在骨内固定物、死骨滋生，导致难以根除的骨组织慢性感染。本研 究旨在制备一种新的抗生素缓释系统，为金黄色葡萄球菌生物膜感染的治疗提供新思路。 方法：制备庆大霉素阳离子脂质体及兔同种异体骨，并采用低温真空负压吸引法将二者复合， 制备成庆大霉素脂质体同种异体骨，并行阳离子脂质体抗生素释放试验。构建金黄色葡萄球 菌生物膜模型，于体外探讨由庆大霉素脂质体同种异体骨中释放出的阳离子脂质体庆大霉素 对细菌生物膜的抑制作用。 结果：成功制备庆大霉素脂质体同种异体骨，可持续释放庆大霉素脂质体达 12 天，前3 天 释放具有爆发效应，所释放的庆大霉素脂质体对金黄色葡萄球菌生物膜生长的抑制作用与新 制备的庆大霉素脂质体相似，二者均明显高于单独使用庆大霉素。 结论：低温真空负压吸引法制备庆大霉素脂质体同种异体骨并不影响所释放的庆大霉素脂质 体的抗菌作用，在体外具有高效抑制金黄色葡萄球菌生物膜的作用，且在低浓度更为明显。 关键词：阳离子脂质体，细菌生物膜，骨髓炎，同种异体骨 慢性骨髓炎是一种细菌生物膜感染[1]。由于细菌生物膜对抗生素的渗透具有阻止作用， 且生物膜底层细菌因特殊的内部微生态环境而生长缓慢，对抗生素不敏感[2]，因而对抗生 素较浮游细菌更为耐药。研究表明，青霉素 G 对金黄色葡萄球菌生物膜的最低抑菌浓度 （minimum inhibitory concentration ，MIC ）是浮游细菌的5000 倍[3]。一旦细菌生物膜在骨 内固定、死骨或周围组织滋生，往往因感染灶难以根除而导致长期慢性感染，给患者带来极 大痛苦。近年来使用的PMMA 、Osteoset T 在局部缓释抗生素，提高了骨髓炎的治疗率，但 PMMA 需二次手术取出，同时有研究表明单纯清创与清创后植入Osteoset T 在骨髓炎的治 愈率方面无明显差异[4]。此外，目前有研究证实，一些高浓度抗生素，如庆大霉素可抑制 人成骨细胞和内皮细胞的增殖，从而影响骨折愈合[5]。 脂质体已广泛用于抗生素、抗肿瘤药物载体，具有天然原料合成、可降解、无毒等优点 [6]，已用于负载各类抗生素[7]。研究证实，阳离子脂质体包裹的万古霉素可有效地靶向金 黄色葡萄球菌生物膜[8]。因此，脂质体是一种有效的抗生素缓释载体，可显著增加细菌生 物膜周围的抗生素浓度，并降低抗生素毒性[9]。然而人体网状内皮系统中的肝脏枯否细胞 及脾脏巨噬细胞对静脉注射的脂质体抗生素具有很强的清除作用[10]，大大降低了抗生素到 达骨组织感染灶的浓度。 本研究旨在建立负载庆大霉素脂质体的同种异体骨，并且检测其释放的庆大霉素脂质体 对金黄色葡萄球菌生物膜的抑制作用。 材料与方法 1 细菌 金黄色葡萄球菌ATCC29213 由昆明医学院微生物教研室惠赠，储存于-70℃。按照Kim 等[11]研究方法配制金黄色葡萄球菌培养基，并储存于4 ℃。在无菌台中以ATCC29213 划板 后置于37℃孵育18h。挑选单菌落置于液体培养基中于37℃培养18h 后以2000 rpm 离心15 分钟，弃去上清，以PBS 重新制成悬液。重复3 次。最后在550nm 将细菌吸光度值调配至 0.1 。 2 金黄色葡萄球菌生物膜微孔板模型的构建 按照Vyas 等人方法[12]制备金黄色葡萄球菌生物膜微孔板模型，即将上述黄色葡萄球菌 悬液200ul 加入96 孔平底微孔板中，室温培养过夜，黄色葡萄球菌生物膜即可在微孔板底 部形成，使用前以PBS 冲洗。 3 阳离子脂质体及同种异体骨的制备 3.1 阳离子脂质体的制备 按照Ravaoarinoro 等人的方法制备阳离子脂质体[13]。即采用磷 酸胆碱（Sigma 产品 no.42556 ），硬脂酰胺（Sigma 产品 no. 85702 ） 及胆固醇（Sigma 产 。三者按照摩尔比1:0.49:0.43 混合于圆底烧瓶中，并于40 ℃真空旋转蒸干器 品no. C8667 ） 中制成脂质膜。 然后加入6ml 浓度为20 mg/ml 的庆大霉素溶液，并于55℃振荡 1h 制成脂 质悬液，于冰浴中超声处理40s 后于4 ℃ 60000 g 离心1h 去除上清中尚未包被的庆大霉素， 沉淀以6ml 双蒸水重悬即制成庆