蛋白质含量测定(考马斯亮蓝G-250法).docVIP

蛋白质含量测定（考马斯亮蓝G－250法） 一、目的 蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。 二、原理 考马斯亮蓝G－250是一种染料，在游离状态下呈红色，当它与蛋白质结合后变为青色。蛋白质含量在0～1000μg范围内，蛋白质一色素结合物在 595nm下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用比色法测定。 三、仪器、试剂和材料 1．仪器 ????? （1）分析天平????? （2）具塞刻度试管???? 10ml× 8????? （3）吸管 0.lml×I，lml×Z，5ml×I????? （4）研钵????? （5）漏斗????? （6）离心管???? 10ml????? （7）容量瓶???? 10ml ?? ???（8）离心机????? （9）721型分光光度计 2．试剂 ??? （1）标准蛋白质溶液 称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成 100 pg／ml的原液。 ??? （2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂 称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入 85％（m／v）的磷酸 100ml，最后用蒸馏水定容到 1000ml。 此溶液在常温下可放置一个月。 3．材料 ??? 绿豆芽 四、操作步骤 1．标准曲线的制作??? 取6支具塞试管，编号后，按下表加入试剂。 管???? 号 操作项目 1?????? 2???????? 3??????? ? 4??????? 5???????? 6 标准蛋白质溶液(ml) 0????? 0.2?????? 0.4?????? 0. 6?????? 0.8??????? 1.0 蒸馏水(ml) 1.0????? 0.8?????? 0.6?????? 0.4??????? 0.2??????? 0 G-250试剂(ml) 各5 蛋白质含量（μg） 0?????? 20?????? 40??????? 60?????? ?80?????? 100 ?盖上塞子，摇匀。放置2min后在595 nm波长下比色测定（比色应在 l h内完成）。以牛血清白蛋白含量（μg）为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘出标准曲线。 2．样品中蛋白质含量的测定 （1）准确称取约200mg绿豆芽下胚轴，放入研钵中，加入5ml蒸馏水在冰浴中研成匀浆，离心（4000r／min，10min），将上清液倒入10ml容量瓶，再向残渣中加入2ml蒸馏水，悬浮后再离心10min，合并上清液，定客至刻度。 （2）另取1支具塞试管，准确加入0.l ml样品提取液，再加入0.9 ml蒸馏水，5ml考马斯亮蓝G－250试剂，充分混合，放置2min后，以标准曲线1号试管做参比，在595 nm波长下比色，记录吸光度。 五、结果处理 根据所测样品提取液的吸光度，在标准曲线上查得相应的蛋白质含量（μg），按下式计算： ? 样品蛋白质含量（μg／g鲜重）＝（查得的蛋白质含量（μg）×提取液总体积（ml））／（样品鲜重（g）×测定时取用提取液的体积（ml）） 六、注意事项 ??? 比色应在出现蓝色2 min～l h内完成。 作者：吕淑霞 来源：生物秀 时间：2008-5-21 一、目的 学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理和方法。 二、原理 考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。 二、材料、主要仪器和试剂 1．实验材料 新鲜绿豆芽 2．主要仪器（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架 （4）研钵（5）离心机