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实时定量PCR技术及其应用 实时定量PCR技术及其应用 2004年5月28日 姓名：肖云刚 学号：12002244128 （宁夏大学生命科学学院，2002级生物技术（1）班） 摘 要：实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是20世纪90年代中期发展起来的一种新型核酸定量技术。该技术具有实时监测，快速，灵敏，精确等特点，是对原有PCR技术的革新，扩大了PCR的应用范围.本文综述了RQ-PCR技术的原理及其应用。 关键词：实时定量，PCR,基因，荧光探针，应用 聚合酶链反应技术(polymerase chain reaction)(PCR)首见报道于1985年，是一种体外扩增DNA片段的技术，已经广泛应用于人类遗传病的基因诊断，产前诊断，临床医学如传染病致病原细菌即病毒的检测，肿瘤，白血病的诊断，癌基因探索等，在分子生物学中应用于基因组DNA或mRNA序列的直接测定，基因分离，克隆，定点致突变，基因突变的直接检测以及法医学等。之所以如此，是由于通过PCR可使极少量复杂的基因组DNA或总RNA样品中特定基因片段，在短短几小时内扩增上百万倍拷贝。 PCR技术自问世以来得到了不断发展，20世纪90 年代发展起来的由美国Applied biosysems公司推出的实时定量PCR(Real-time Quantitative Polymerase chain Reaction,RQ-PCR)技术是一种在PCR反应体系中加入荧光基因利用荧光信号积累实时检测整个PCR过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它除了具有PCR的高灵敏性外，还具有可直接监测扩增中的荧光信号变化获得定量结果，精确性高；定量和扩增同步进行，克服了PCR的平台效应；特异性和可靠性更强；能实现多重反应；无污染性；具实时性和可靠性等特点，目前已广泛应用于分子生物学研究领域和医学研究等领域。 1：实时定量PCR技术的概述 1. 1两个重要概念的说明 （1）荧光阈值（threshold）:以PCR反应的前15个循环的荧光信号，一般荧光阈值定义为3~15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍。 （2）Ct值：也称循环阈值，C代表Cycle,t代表threshold。Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定的阈值是所经历的循环数（如图1所示）。经数学证明，Ct值与模板DNA的起始拷贝数成反比。利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，其中横坐标代表起始拷贝数的对数，纵坐标代表Ct值（如图2所示）。这样，只要获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。 11.2 作用原理 RQ-PCR技术是指在PC反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。它在常规PCR基础上添加了荧光染料或荧光探针。荧光染料能特异性掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入双链中的染料分子不发出荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物增加完全同步。实时定量PCR常用的检测模式有TaqMan探针和SYRB Green 1检测模式。 （1） TaqMan探针方法的作用原理 这种方法的原理主要是利用DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性并在PCR过程中,反应体系加入一个荧光标记探针.TapMan探针根据其3’端标记的荧光淬灭基团的不同分为两种:常规TapMan探针和TapMan MGB探针。 常规TapMan探针利用合适的DNA的5’-3’核酸外切酶（常用Tap酶）活性，特异性的切割探针5’端的荧光基团。该探针的5’端和3’端分别标记一个报告荧光基团FAM（6-羧基荧光素）和一个淬灭荧光基团TAMRA（6-羧基四甲基若丹明）。当溶液中有PCR产物时，该探针与模板退火，即产生了适合于核酸外切酶活性的底物，从而将探针5’端连接的荧光分子从探针上切割下来，破坏两荧光分子间的PRET,发出荧光。 2000年，美国Applied Biosystems公司开发了一种新的TapMan探针----MGB探针。这种荧光探针与常规TapMan探针相比，有两个主要的不同：一是探针3’端标记了自身不发光的淬灭荧光分子，以取代常规可发光的TAMRA荧光标记。这使荧光本底降低，荧光光谱分辨率得以大大改善。二是探针3’端另结合了MGB(minor groove binder)结合物，使得探针的Tm值提高，大大增加了探针的杂交稳定性，使结果更精确，分辨率更高。实验证明，TapMan MGB探针对等位基因的区分更为理想，甚至能检测仅有单核苷酸差异的等位基因的表达水平。 （