酶联免疫吸附剂测定实验.docVIP

实验名称：酶联免疫吸附剂测定（ELISA） 系别：机械工程系 班号：机械11 姓名：潘霖 （同组姓名：肖鹤翀） 作实验日期：2011年 10 月 16 日 学号：2011010389 实验原理 本实验采用的间接法测定抗体。大体方法为使抗原结合到细胞培养板表面，并保持其免疫活性。加抗体（一抗）形成抗原-抗体复合物；加酶标抗体；加底物（邻苯二胺溶液，用于测定其降解量。底物的降解量=抗体量）由于酶的催化频率很高，故可极大地放大反应效果，从而使测定方法达到很高的敏感度。 实验材料与试剂 聚苯乙烯微量细胞培养板（平板，96孔，本次实验仅用其中30孔，为2B~11D） 酶联免疫检测仪 辣根过氧化物酶羊抗兔IgG。 包被液：0.05mol/L碳酸缓冲液（pH=9.6），其中碳酸钠0.15g，碳酸氢钠0.294g。 稀释液（PBS-Tween） Tween-20,0.5ml，蒸馏水加至1000ml。 洗涤液：同稀释液。 封闭液：质量分数为0.5%的BSA（用PBS配置）。 邻苯二胺溶液（底物） 终止液：2mol/L H2SO4。 实验步骤 1．包被抗原： 用包被液将抗原作适当稀释, 一般为1~10微克/孔，每孔加200微升, 37 ℃温育半小时。 2．洗涤：倒尽板孔中液体（注意垂直迅速倒下，防止污染），加200微升洗涤液，反复三次，最后将反应板倒置在吸水纸上，使孔中洗涤液流尽。 3．加封闭液200微升，37 ℃温育半小时。 4．洗涤同2。 5．加被检血清： 用稀释液将被检血清作几种稀释，每孔200微升。同时作稀释液对照。37 ℃温育一小时。 6．洗涤同2。 7．加辣根过氧化物酶羊抗兔IgG, 每孔200微升, 37 ℃温育半小时。 8．洗涤同2。 9．加底物：邻苯二胺溶液加200微升，室温暗处5分钟。 10．加终止液：每孔50微升。 11．观察结果：用酶联免疫检测仪记录OD490nm读数。 实验结果与总结 实验结果（主要以图表形式展出） 实验测定原始数据表 组数 一抗稀释倍数 A490 B C D 平均 (无红色标记) 1 空白 0.003 0.004 0.004 0.004 2 1/400 1.191 1.051 1.006 1.083 3 1/800 0.894 1.026 0.950 0.957 4 1/1600 1.016 1.245 0.987 1.083 5 1/3200 0.908 1.015 1.089 1.004 6 1/6400 0.844 0.897 0.637 0.871 7 1/12800 0.643 0.801 0.602 0.623 8 1/25600 0.553 0.507 0.513 0.524 9 1/51200 0.411 0.420 0.366 0.399 10 不加一抗 0.079 0.590 0.122 0.101 11 不加抗原 0.115 0.108 0.092 0.105 12 空白 0.005 0.005 0.005 0.005 实验测定数据折线图（平均~一抗稀释倍数） 实验总结 由于我一开始并不晓得本实验的英文缩写为ELISA，部分导致了我在实验前并不知道本次实验是什么，所以没有充分做好课前准备。这次实验比较难（至少我认为），加上余老师给力的半英文教学，我一开始一直晕晕乎乎不知道什么状况。这首先给我两个教训：其一，对待学习要足够认真严肃，上课前要做好预习工作，不可以马虎；其二，要学好英语。 本次实验所运用的间接测定法给我印象很深，尤其是对二抗的使用；另外，封闭液的使用也很巧妙。这两个非常有创意的方法非常成功的达到了实验目的。其实不只是这个实验，像这样别出心裁的想法在很多别的实验上也非常具有借鉴意义，其思维方法值得学习。